劉 標(biāo)，尹紅梅，劉惠知

（湖南省微生物研究院，長沙 410009）

0 引 言

隨著中國生豬養(yǎng)殖和加工業(yè)的快速發(fā)展，每年產(chǎn)生了大量的廢棄豬毛，大部分豬毛被填埋或焚燒處理，這些處理方法對生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染。豬毛富含 α-角蛋白，含量高達(dá)95%以上[1]，如果對這些廢棄蛋白進行降解回收利用，不僅可以改善生態(tài)環(huán)境，其降解產(chǎn)物可廣泛用于飼料蛋白源及有機肥。

角蛋白在分子內(nèi)和分子間存在二硫鍵、氫鍵、配位鍵和范德華力等多種鍵能，三維構(gòu)象高度交聯(lián)，性質(zhì)穩(wěn)定，不容易被普通的蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）水解，因此給資源化利用帶來了困難。根據(jù)文獻報道[2]，豬毛角蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為 α-螺旋，半胱氨酸的含量高（二硫鍵多），比羽毛角蛋白（β-螺旋）結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，更難降解。研究表明，自然界中的某些微生物能夠?qū)⒔堑鞍捉到獬尚‰?、氨基酸等動物可以消化利用的成分，利用微生物對角蛋白廢棄物進行無害化處理是一種高效、環(huán)保、低成本的轉(zhuǎn)化方式。近年來，利用微生物降解角蛋白引起了研究工作者的廣泛關(guān)注，目前已報道能降解羽毛角蛋白的微生物包括細(xì)菌、真菌、放線菌[3－14]，如枯草芽孢桿菌、金黃色節(jié)桿菌、淡擬紫青霉和鏈霉菌等菌種，但專門針對豬毛角蛋白高效降解的微生物僅有少數(shù)報道[15－16]。因此，本研究從生豬屠宰場周邊土壤中取樣，篩選到一株高效降解豬毛角蛋白的微生物菌株，并對其進行了分類鑒定及降解特性的研究，旨在豐富降解豬毛角蛋白的微生物資源，為豬毛廢棄物的無害化處理和資源化利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株分離樣品

長沙市某生豬屠宰場周圍長期堆積廢棄豬毛處的土壤樣品。

1.1.2 角蛋白材料

各種廢棄毛發(fā)的獲?。菏占涝讏鲋苓厪U棄的豬毛、雞毛、鵝毛、鴨毛、羊毛，用蒸餾水沖洗干凈，60 ℃烘干水分至恒定質(zhì)量。

豬毛粉制備：將烘干后的豬毛粉碎，過80目篩后即制成豬毛粉。

1.1.3 培養(yǎng)基

選擇培養(yǎng)基：豬毛粉 10.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH值為7.0。降解培養(yǎng)基：豬毛 10 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH值為7.0牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH值為7.0。以上所有培養(yǎng)基均121 ℃高溫滅菌20 min待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 高效豬毛角蛋白降解菌的分離及篩選

稱取1.1.1中采集的土壤樣品10.0 g置于內(nèi)含90 mL無菌水的錐形瓶中，充分振蕩混勻。取5 mL混合液置于內(nèi)含100 mL選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)。取馴化培養(yǎng)96 h的菌液梯度稀釋后，涂布在固體選擇培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基中添加2%瓊脂）平板上培養(yǎng)3 d，篩選生長良好的單菌落，利用四分區(qū)劃線法進一步純化，牛肉膏蛋白胨試管斜面低溫保存各菌株。

1.2.2 初篩菌株豬毛角蛋白降解率的測定

將初篩獲得的角蛋白降解菌接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h（30 ℃，180 r/min）獲得種子液，調(diào)節(jié)各種子液的活菌數(shù)約為3.0×108CFU/mL。將各種子液以2%接種量分別接種到以豬毛為唯一碳氮源的降解培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)，觀察豬毛的降解狀況，接種等量無菌水作為對照。分別在第 3、5、7天，采用失質(zhì)量法測定豬毛的降解率[16]，即將培養(yǎng)液利用濾紙過濾，收集殘渣至干燥箱內(nèi)干燥至恒定質(zhì)量，稱量殘渣質(zhì)量，計算各菌株的豬毛角蛋白降解率。降解率的計算公式如下

豬毛降解率=（對照豬毛干質(zhì)量-試驗組豬毛殘渣干質(zhì)量）/對照豬毛干質(zhì)量×100% （1）

1.2.3 高效豬毛角蛋白降解菌X-3的菌種鑒定

菌株形態(tài)及生理生化鑒定：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)特征，在油鏡下觀察菌體形態(tài)。菌株生理生化性質(zhì)的鑒定參照《微生物學(xué)實驗教程》（第2版）[17]。

菌株16S rDNA序列分析：用DNA提取試劑盒提取菌株X-3的基因組DNA，采用16S rDNA通用引物27F ： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， 1492R ：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行 PCR 擴增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，反應(yīng)進行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃終止。將PCR產(chǎn)物回收純化后委托上海生物工程股份有限公司測序。

PCR產(chǎn)物測得的序列在NCBI中運用Blast進行同源性分析，利用Mega 5.0軟件中Neighbor-Joining法構(gòu)建基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)取樣1 000次進行bootstrap檢驗，確定該菌的種屬。

1.2.4 菌株X-3對不同來源角蛋白的降解效果分析

為了探究菌株 X-3對幾種常見角蛋白底物的降解效率，分別在降解培養(yǎng)基中添加豬毛、雞毛、鴨毛、鵝毛、羊毛進行降解試驗，降解培養(yǎng)基中各種毛發(fā)的添加量均為10 g/L，接種量為2%（體積分?jǐn)?shù)），30 ℃，180 r/min培養(yǎng)，在第7 d采用失質(zhì)量法測定降解率，以接種等量無菌水為對照，降解率的計算方法同1.2.2中所述。

1.2.5 菌株X-3降解豬毛角蛋白機理的初步研究

1）菌株X-3降解豬毛角蛋白產(chǎn)物分析

接種一環(huán)菌株X-3到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h制成種子液，調(diào)節(jié)種子液的活菌數(shù)約為3.0×108CFU/mL。以2%接種量接種種子液到選擇培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)，分別在第1、2、3、4、5、6、7天測定角蛋白的降解率、發(fā)酵上清液中胞外角蛋白酶活、胞外二硫鍵還原酶活性、可溶性蛋白含量、各種含硫化合物（巰基化合物、硫酸鹽、亞硫酸鹽）含量，每個處理重復(fù)3次。

2）各成分分析測定方法

發(fā)酵液4 ℃、5 000×g離心10 min后，經(jīng)0.22 μm過濾器過濾后即制成胞外粗酶液。胞外角蛋白酶活性、二硫鍵還原酶活性、可溶性蛋白含量的測定參照齊治國等[18]研究中介紹的方法進行，發(fā)酵上清液中各種含硫化合物的含量測定參照黃林等[19]研究的方法進行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2003進行初步計算，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并繪圖；利用軟件SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)間差異顯著性比較采用One-way ANOVA方法進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效豬毛角蛋白菌株的分離篩選

經(jīng)馴化篩選后，共分離篩選到 6株能夠利用豬毛粉作為碳氮源生長的細(xì)菌菌株，分別編號為X-1、X-3、X-4、X-6、X-7、X-8。將6株菌株接種到降解培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，第 7天時各培養(yǎng)基中的豬毛都有被降解的現(xiàn)象，其中，接種菌株 X-3的錐形瓶中豬毛降解程度最高，培養(yǎng)液明顯變渾濁，菌株生長旺盛（圖1）。6株菌株在不同時間點對豬毛角蛋白的降解率如表 1所示，結(jié)果顯示，菌株X-3在各時間點對豬毛的降解率均為最高，第7天時，降解率達(dá)77.3%，降解效果顯著強于其他菌株。因此，選取菌株X-3進行下一步深入研究。

圖1 菌株X-3對豬毛底物的降解效果Fig.1 Pig hair degradation effect of strain X-3

表1 不同菌株對豬毛角蛋白的降解率Table 1 Degradation rate of different strains to pig hair keratin%

2.2 高效降解菌X-3菌種鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化試驗結(jié)果

將菌株X-3接種在牛肉膏蛋白胨平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h后，可以觀察到菌落正面呈白色，反面呈淡黃色，邊緣不整齊，表面干燥光滑（圖 2a）。在油鏡下觀察，菌株X-3營養(yǎng)體呈桿狀，單個排列，可形成芽孢（圖2b）。菌株生理生化試驗結(jié)果如表 2所述，與已報道的凝結(jié)芽孢桿菌的生化特征相符合。

圖2 菌株X-3菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征Fig.2 Colony morphology and micromorphological characteristics of strain X-3

表2 菌株X-3的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain X-3

2.2.2 菌株16S rDNA序列分析結(jié)果

測序結(jié)果顯示，菌株 16S rDNA擴增序列長度為1 456 bp，將其序列提交到 Genbank數(shù)據(jù)庫（登錄號MK182787），并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast分析，根據(jù)同源性比對結(jié)果，利用 Mega 5.0軟件構(gòu)建基于 16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖3所示，菌株與凝結(jié)芽孢桿菌的進化距離最近。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和 16S rDNA序列分析的結(jié)果，初步將菌株 X-3鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。

圖3 基于菌株X-3 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain X-3

2.3 菌株X-3對不同來源角蛋白的降解能力

圖4 結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)7 d后，菌株X-3對雞毛、鵝毛的降解率分別為86.7%、88.4%，顯著優(yōu)于對其他 3種角蛋白底物的降解率（P＜0.05）。菌株對豬毛、羊毛、雞毛、鵝毛、鴨毛等角蛋白底物的降解率均大于 60%，說明其對不同來源的角蛋白均具有較好的降解效果，是一株廣譜的角蛋白降解菌。

圖4 菌株X-3對不同角蛋白的降解效果Fig.4 Degradation effect of strain X-3 to different keratins

2.4 菌株X-3降解豬毛角蛋白的機理初探

2.4.1 角蛋白降解率與角蛋白酶活性、二硫鍵還原酶活性的變化趨勢

圖 5結(jié)果顯示，在以豬毛角蛋白為唯一碳氮源的培養(yǎng)基中，菌株X-3搖瓶發(fā)酵7 d時間內(nèi)，豬毛角蛋白的降解率、角蛋白酶活性和二硫鍵還原酶活性均表現(xiàn)出先增大后保持穩(wěn)定的變化趨勢。前5 d，豬毛角蛋白的降解率、角蛋白酶活性和二硫鍵還原酶活性均隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大，此后，無顯著性變化。豬毛角蛋白降解率與角蛋白酶活、二硫鍵還原酶活之間均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.964、0.975，說明豬毛角蛋白的降解依賴于菌株 X-3產(chǎn)生的角蛋白酶和二硫鍵還原酶活力的大小。

圖5 菌株X-3發(fā)酵過程中角蛋白降解率與角蛋白酶活性、二硫鍵還原酶活性的變化Fig.5 Keratinase, disulfide reductase activity and keratin degrading rate during fermentation by strain X-3

2.4.2 菌株X-3降解角蛋白過程可溶性蛋白及各種含硫化合物的變化

表3結(jié)果表明，菌株X-3在降解豬毛角蛋白的過程中，產(chǎn)生了大量的可溶性蛋白，角蛋白中的硫元素也隨之轉(zhuǎn)化為硫酸鹽、亞硫酸鹽和巰基化合物等多種形式的含硫化合物。發(fā)酵前5 d，可溶性蛋白的含量不斷增加，質(zhì)量濃度最高達(dá)863.4 μg/mL，此后稍有下降，推測是后期微生物對可溶性蛋白的利用速度大于可溶性蛋白生成的速度導(dǎo)致。角蛋白中二硫鍵中的硫主要轉(zhuǎn)化為硫酸鹽，其含量顯著高于同時期亞硫酸鹽、巰基化合物的含量（P＜0.05）。

表3 角蛋白降解過程中可溶性蛋白及含硫化合物質(zhì)量濃度變化Table 3 Content change of soluable protein and sulfur compounds during degradation of keratin

3 討 論

利用微生物降解豬毛角蛋白不僅能夠有效改善生態(tài)環(huán)境，而且可以增加蛋白質(zhì)飼料的供給[20－21]。本研究以含二硫鍵較多的 α-角蛋白（豬毛）為降解對象，分離篩選到的凝結(jié)芽孢桿菌X-3對α-角蛋白和β-角蛋白均具有較好的降解效果，應(yīng)用范圍廣。凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)可用于動物飼料添加的安全微生物菌種，它可以維持腸道微生態(tài)平衡、提高動物的免疫力，同時由于其能產(chǎn)生芽孢，具有抗逆性強、易儲存等優(yōu)點，該菌種在益生菌領(lǐng)域成為了研究熱點[22－24]。根據(jù)文獻檢索，目前未見有將凝結(jié)芽孢桿菌用于降解角蛋白方面的報道。因此，本研究篩選到的Bacillus coagulans X-3豐富了豬毛角蛋白降解的菌種資源，在廢棄角蛋白的資源化利用方面具有較好的應(yīng)用前景。

根據(jù)文獻報道[25]，微生物降解角蛋白的過程可分為以下 2個步驟：首先，角蛋白結(jié)構(gòu)中二硫鍵遭到破壞，角蛋白分子變得疏松，角蛋白初步變性；然后，在蛋白水解酶或別的物理化學(xué)因素的作用下將變性的角蛋白水解，最終降解成肽段、氨基酸等小分子物質(zhì)。角蛋白中二硫鍵起主要穩(wěn)定作用，降解角蛋白的關(guān)鍵步驟是二硫鍵的斷裂。

目前，研究工作者總結(jié)出 3種主要的角蛋白二硫鍵斷裂途徑，即二硫鍵還原酶裂解途徑、真菌菌絲體機械穿透裂解途徑、亞硫酸鹽裂解途徑[26]。本研究篩選獲得的菌株 X-3在降解角蛋白過程中能夠分泌胞外二硫鍵還原酶，而且其酶活與角蛋白降解率存在較強的相關(guān)性，說明該菌株主要依靠二硫鍵還原酶斷裂二硫鍵，然后由角蛋白酶進一步水解變性的角蛋白。根據(jù)已有的文獻報道[18,27-28]，目前僅在放線菌、真菌等能夠產(chǎn)生菌絲體的微生物中發(fā)現(xiàn)有機械力破壞角蛋白二硫鍵的機制，而凝結(jié)芽孢桿菌X-3是細(xì)菌，顯然不具有類似能力。

關(guān)于亞硫酸鹽裂解途徑，有學(xué)者在研究真菌降解角蛋白的試驗中得出結(jié)論：菌株首先會分泌亞硫酸鹽斷裂二硫鍵，然后變性的蛋白質(zhì)進一步被蛋白酶降解[29－30]。菌株 X-3在降解角蛋白二硫鍵的過程中也伴隨著亞硫酸鹽的生成，亞硫酸鹽是否在二硫鍵的斷裂過程中起到作用，本研究沒有進一步深入，因此，下一步計劃添加不同濃度的亞硫酸鹽到菌株 X-3的降解培養(yǎng)基及胞外粗酶液中，檢測對角蛋白降解效率的影響。

為了進一步挖掘該菌在降解角蛋白方面的潛能，還有許多的工作需要進一步深入研究，如優(yōu)化該菌株的最佳產(chǎn)酶及降解角蛋白的環(huán)境條件、X-3降解角蛋白的分子機理也有待進一步深入。

4 結(jié) 論

本研究篩選到一株高效的豬毛角蛋白降解菌株X-3，其對豬毛降解率高達(dá)77.3%。綜合菌株形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，初步鑒定該菌株為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。菌株X-3對α-角蛋白（豬毛、羊毛）和 β-角蛋白（雞毛、鵝毛、鴨毛）的降解率均大于 60%，是一株高效的廣譜角蛋白降解菌。菌株對豬毛角蛋白的降解依賴于其產(chǎn)生的角蛋白酶和二硫鍵還原酶活力的大小，在降解過程中產(chǎn)生了大量的可溶性蛋白，二硫鍵中的硫也隨之轉(zhuǎn)化為硫酸鹽、亞硫酸鹽和巰基化合物，表明菌株 X-3在利用角蛋白的過程中存在酶降解途徑，但是否具有亞硫酸鹽降解途徑有待進一步驗證。

本試驗篩選的高效安全降解菌株 X-3可將豬毛角蛋白降解成易被動物體消化利用的可溶性蛋白、多肽、氨基酸等產(chǎn)物，可用于廢棄豬毛角蛋白的資源化利用，具有廣闊的應(yīng)用潛力。