劉 標(biāo)，尹紅梅，劉惠知

（湖南省微生物研究院，長沙 410009）

0 引 言

隨著中國生豬養(yǎng)殖和加工業(yè)的快速發(fā)展，每年產(chǎn)生了大量的廢棄豬毛，大部分豬毛被填埋或焚燒處理，這些處理方法對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染。豬毛富含 α-角蛋白，含量高達(dá)95%以上[1]，如果對(duì)這些廢棄蛋白進(jìn)行降解回收利用，不僅可以改善生態(tài)環(huán)境，其降解產(chǎn)物可廣泛用于飼料蛋白源及有機(jī)肥。

角蛋白在分子內(nèi)和分子間存在二硫鍵、氫鍵、配位鍵和范德華力等多種鍵能，三維構(gòu)象高度交聯(lián)，性質(zhì)穩(wěn)定，不容易被普通的蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）水解，因此給資源化利用帶來了困難。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]，豬毛角蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為 α-螺旋，半胱氨酸的含量高（二硫鍵多），比羽毛角蛋白（β-螺旋）結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，更難降解。研究表明，自然界中的某些微生物能夠?qū)⒔堑鞍捉到獬尚‰?、氨基酸等?dòng)物可以消化利用的成分，利用微生物對(duì)角蛋白廢棄物進(jìn)行無害化處理是一種高效、環(huán)保、低成本的轉(zhuǎn)化方式。近年來，利用微生物降解角蛋白引起了研究工作者的廣泛關(guān)注，目前已報(bào)道能降解羽毛角蛋白的微生物包括細(xì)菌、真菌、放線菌[3－14]，如枯草芽孢桿菌、金黃色節(jié)桿菌、淡擬紫青霉和鏈霉菌等菌種，但專門針對(duì)豬毛角蛋白高效降解的微生物僅有少數(shù)報(bào)道[15－16]。因此，本研究從生豬屠宰場周邊土壤中取樣，篩選到一株高效降解豬毛角蛋白的微生物菌株，并對(duì)其進(jìn)行了分類鑒定及降解特性的研究，旨在豐富降解豬毛角蛋白的微生物資源，為豬毛廢棄物的無害化處理和資源化利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株分離樣品

長沙市某生豬屠宰場周圍長期堆積廢棄豬毛處的土壤樣品。

1.1.2 角蛋白材料

各種廢棄毛發(fā)的獲?。菏占涝讏鲋苓厪U棄的豬毛、雞毛、鵝毛、鴨毛、羊毛，用蒸餾水沖洗干凈，60 ℃烘干水分至恒定質(zhì)量。

豬毛粉制備：將烘干后的豬毛粉碎，過80目篩后即制成豬毛粉。

1.1.3 培養(yǎng)基

選擇培養(yǎng)基：豬毛粉 10.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH值為7.0。降解培養(yǎng)基：豬毛 10 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH值為7.0牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH值為7.0。以上所有培養(yǎng)基均121 ℃高溫滅菌20 min待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高效豬毛角蛋白降解菌的分離及篩選

稱取1.1.1中采集的土壤樣品10.0 g置于內(nèi)含90 mL無菌水的錐形瓶中，充分振蕩混勻。取5 mL混合液置于內(nèi)含100 mL選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)。取馴化培養(yǎng)96 h的菌液梯度稀釋后，涂布在固體選擇培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基中添加2%瓊脂）平板上培養(yǎng)3 d，篩選生長良好的單菌落，利用四分區(qū)劃線法進(jìn)一步純化，牛肉膏蛋白胨試管斜面低溫保存各菌株。

1.2.2 初篩菌株豬毛角蛋白降解率的測定

將初篩獲得的角蛋白降解菌接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h（30 ℃，180 r/min）獲得種子液，調(diào)節(jié)各種子液的活菌數(shù)約為3.0×108CFU/mL。將各種子液以2%接種量分別接種到以豬毛為唯一碳氮源的降解培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)，觀察豬毛的降解狀況，接種等量無菌水作為對(duì)照。分別在第 3、5、7天，采用失質(zhì)量法測定豬毛的降解率[16]，即將培養(yǎng)液利用濾紙過濾，收集殘?jiān)粮稍锵鋬?nèi)干燥至恒定質(zhì)量，稱量殘?jiān)|(zhì)量，計(jì)算各菌株的豬毛角蛋白降解率。降解率的計(jì)算公式如下

豬毛降解率=（對(duì)照豬毛干質(zhì)量-試驗(yàn)組豬毛殘?jiān)少|(zhì)量）/對(duì)照豬毛干質(zhì)量×100% （1）

1.2.3 高效豬毛角蛋白降解菌X-3的菌種鑒定

菌株形態(tài)及生理生化鑒定：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)特征，在油鏡下觀察菌體形態(tài)。菌株生理生化性質(zhì)的鑒定參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》（第2版）[17]。

菌株16S rDNA序列分析：用DNA提取試劑盒提取菌株X-3的基因組DNA，采用16S rDNA通用引物27F ： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， 1492R ：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃終止。將PCR產(chǎn)物回收純化后委托上海生物工程股份有限公司測序。

PCR產(chǎn)物測得的序列在NCBI中運(yùn)用Blast進(jìn)行同源性分析，利用Mega 5.0軟件中Neighbor-Joining法構(gòu)建基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)取樣1 000次進(jìn)行bootstrap檢驗(yàn)，確定該菌的種屬。

1.2.4 菌株X-3對(duì)不同來源角蛋白的降解效果分析

為了探究菌株 X-3對(duì)幾種常見角蛋白底物的降解效率，分別在降解培養(yǎng)基中添加豬毛、雞毛、鴨毛、鵝毛、羊毛進(jìn)行降解試驗(yàn)，降解培養(yǎng)基中各種毛發(fā)的添加量均為10 g/L，接種量為2%（體積分?jǐn)?shù)），30 ℃，180 r/min培養(yǎng)，在第7 d采用失質(zhì)量法測定降解率，以接種等量無菌水為對(duì)照，降解率的計(jì)算方法同1.2.2中所述。

1.2.5 菌株X-3降解豬毛角蛋白機(jī)理的初步研究

1）菌株X-3降解豬毛角蛋白產(chǎn)物分析

接種一環(huán)菌株X-3到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h制成種子液，調(diào)節(jié)種子液的活菌數(shù)約為3.0×108CFU/mL。以2%接種量接種種子液到選擇培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)，分別在第1、2、3、4、5、6、7天測定角蛋白的降解率、發(fā)酵上清液中胞外角蛋白酶活、胞外二硫鍵還原酶活性、可溶性蛋白含量、各種含硫化合物（巰基化合物、硫酸鹽、亞硫酸鹽）含量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2）各成分分析測定方法

發(fā)酵液4 ℃、5 000×g離心10 min后，經(jīng)0.22 μm過濾器過濾后即制成胞外粗酶液。胞外角蛋白酶活性、二硫鍵還原酶活性、可溶性蛋白含量的測定參照齊治國等[18]研究中介紹的方法進(jìn)行，發(fā)酵上清液中各種含硫化合物的含量測定參照黃林等[19]研究的方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2003進(jìn)行初步計(jì)算，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并繪圖；利用軟件SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)間差異顯著性比較采用One-way ANOVA方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效豬毛角蛋白菌株的分離篩選

經(jīng)馴化篩選后，共分離篩選到 6株能夠利用豬毛粉作為碳氮源生長的細(xì)菌菌株，分別編號(hào)為X-1、X-3、X-4、X-6、X-7、X-8。將6株菌株接種到降解培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，第 7天時(shí)各培養(yǎng)基中的豬毛都有被降解的現(xiàn)象，其中，接種菌株 X-3的錐形瓶中豬毛降解程度最高，培養(yǎng)液明顯變渾濁，菌株生長旺盛（圖1）。6株菌株在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)豬毛角蛋白的降解率如表 1所示，結(jié)果顯示，菌株X-3在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)豬毛的降解率均為最高，第7天時(shí)，降解率達(dá)77.3%，降解效果顯著強(qiáng)于其他菌株。因此，選取菌株X-3進(jìn)行下一步深入研究。

圖1 菌株X-3對(duì)豬毛底物的降解效果Fig.1 Pig hair degradation effect of strain X-3

表1 不同菌株對(duì)豬毛角蛋白的降解率Table 1 Degradation rate of different strains to pig hair keratin%

2.2 高效降解菌X-3菌種鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果

將菌株X-3接種在牛肉膏蛋白胨平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h后，可以觀察到菌落正面呈白色，反面呈淡黃色，邊緣不整齊，表面干燥光滑（圖 2a）。在油鏡下觀察，菌株X-3營養(yǎng)體呈桿狀，單個(gè)排列，可形成芽孢（圖2b）。菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表 2所述，與已報(bào)道的凝結(jié)芽孢桿菌的生化特征相符合。

圖2 菌株X-3菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征Fig.2 Colony morphology and micromorphological characteristics of strain X-3

表2 菌株X-3的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain X-3

2.2.2 菌株16S rDNA序列分析結(jié)果

測序結(jié)果顯示，菌株 16S rDNA擴(kuò)增序列長度為1 456 bp，將其序列提交到 Genbank數(shù)據(jù)庫（登錄號(hào)MK182787），并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析，根據(jù)同源性比對(duì)結(jié)果，利用 Mega 5.0軟件構(gòu)建基于 16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示，菌株與凝結(jié)芽孢桿菌的進(jìn)化距離最近。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和 16S rDNA序列分析的結(jié)果，初步將菌株 X-3鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。

圖3 基于菌株X-3 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain X-3

2.3 菌株X-3對(duì)不同來源角蛋白的降解能力

圖4 結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)7 d后，菌株X-3對(duì)雞毛、鵝毛的降解率分別為86.7%、88.4%，顯著優(yōu)于對(duì)其他 3種角蛋白底物的降解率（P＜0.05）。菌株對(duì)豬毛、羊毛、雞毛、鵝毛、鴨毛等角蛋白底物的降解率均大于 60%，說明其對(duì)不同來源的角蛋白均具有較好的降解效果，是一株廣譜的角蛋白降解菌。

圖4 菌株X-3對(duì)不同角蛋白的降解效果Fig.4 Degradation effect of strain X-3 to different keratins

2.4 菌株X-3降解豬毛角蛋白的機(jī)理初探

2.4.1 角蛋白降解率與角蛋白酶活性、二硫鍵還原酶活性的變化趨勢

圖 5結(jié)果顯示，在以豬毛角蛋白為唯一碳氮源的培養(yǎng)基中，菌株X-3搖瓶發(fā)酵7 d時(shí)間內(nèi)，豬毛角蛋白的降解率、角蛋白酶活性和二硫鍵還原酶活性均表現(xiàn)出先增大后保持穩(wěn)定的變化趨勢。前5 d，豬毛角蛋白的降解率、角蛋白酶活性和二硫鍵還原酶活性均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸增大，此后，無顯著性變化。豬毛角蛋白降解率與角蛋白酶活、二硫鍵還原酶活之間均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.964、0.975，說明豬毛角蛋白的降解依賴于菌株 X-3產(chǎn)生的角蛋白酶和二硫鍵還原酶活力的大小。

圖5 菌株X-3發(fā)酵過程中角蛋白降解率與角蛋白酶活性、二硫鍵還原酶活性的變化Fig.5 Keratinase, disulfide reductase activity and keratin degrading rate during fermentation by strain X-3

2.4.2 菌株X-3降解角蛋白過程可溶性蛋白及各種含硫化合物的變化

表3結(jié)果表明，菌株X-3在降解豬毛角蛋白的過程中，產(chǎn)生了大量的可溶性蛋白，角蛋白中的硫元素也隨之轉(zhuǎn)化為硫酸鹽、亞硫酸鹽和巰基化合物等多種形式的含硫化合物。發(fā)酵前5 d，可溶性蛋白的含量不斷增加，質(zhì)量濃度最高達(dá)863.4 μg/mL，此后稍有下降，推測是后期微生物對(duì)可溶性蛋白的利用速度大于可溶性蛋白生成的速度導(dǎo)致。角蛋白中二硫鍵中的硫主要轉(zhuǎn)化為硫酸鹽，其含量顯著高于同時(shí)期亞硫酸鹽、巰基化合物的含量（P＜0.05）。

表3 角蛋白降解過程中可溶性蛋白及含硫化合物質(zhì)量濃度變化Table 3 Content change of soluable protein and sulfur compounds during degradation of keratin

3 討 論

利用微生物降解豬毛角蛋白不僅能夠有效改善生態(tài)環(huán)境，而且可以增加蛋白質(zhì)飼料的供給[20－21]。本研究以含二硫鍵較多的 α-角蛋白（豬毛）為降解對(duì)象，分離篩選到的凝結(jié)芽孢桿菌X-3對(duì)α-角蛋白和β-角蛋白均具有較好的降解效果，應(yīng)用范圍廣。凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)可用于動(dòng)物飼料添加的安全微生物菌種，它可以維持腸道微生態(tài)平衡、提高動(dòng)物的免疫力，同時(shí)由于其能產(chǎn)生芽孢，具有抗逆性強(qiáng)、易儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)，該菌種在益生菌領(lǐng)域成為了研究熱點(diǎn)[22－24]。根據(jù)文獻(xiàn)檢索，目前未見有將凝結(jié)芽孢桿菌用于降解角蛋白方面的報(bào)道。因此，本研究篩選到的Bacillus coagulans X-3豐富了豬毛角蛋白降解的菌種資源，在廢棄角蛋白的資源化利用方面具有較好的應(yīng)用前景。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[25]，微生物降解角蛋白的過程可分為以下 2個(gè)步驟：首先，角蛋白結(jié)構(gòu)中二硫鍵遭到破壞，角蛋白分子變得疏松，角蛋白初步變性；然后，在蛋白水解酶或別的物理化學(xué)因素的作用下將變性的角蛋白水解，最終降解成肽段、氨基酸等小分子物質(zhì)。角蛋白中二硫鍵起主要穩(wěn)定作用，降解角蛋白的關(guān)鍵步驟是二硫鍵的斷裂。

目前，研究工作者總結(jié)出 3種主要的角蛋白二硫鍵斷裂途徑，即二硫鍵還原酶裂解途徑、真菌菌絲體機(jī)械穿透裂解途徑、亞硫酸鹽裂解途徑[26]。本研究篩選獲得的菌株 X-3在降解角蛋白過程中能夠分泌胞外二硫鍵還原酶，而且其酶活與角蛋白降解率存在較強(qiáng)的相關(guān)性，說明該菌株主要依靠二硫鍵還原酶斷裂二硫鍵，然后由角蛋白酶進(jìn)一步水解變性的角蛋白。根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道[18,27-28]，目前僅在放線菌、真菌等能夠產(chǎn)生菌絲體的微生物中發(fā)現(xiàn)有機(jī)械力破壞角蛋白二硫鍵的機(jī)制，而凝結(jié)芽孢桿菌X-3是細(xì)菌，顯然不具有類似能力。

關(guān)于亞硫酸鹽裂解途徑，有學(xué)者在研究真菌降解角蛋白的試驗(yàn)中得出結(jié)論：菌株首先會(huì)分泌亞硫酸鹽斷裂二硫鍵，然后變性的蛋白質(zhì)進(jìn)一步被蛋白酶降解[29－30]。菌株 X-3在降解角蛋白二硫鍵的過程中也伴隨著亞硫酸鹽的生成，亞硫酸鹽是否在二硫鍵的斷裂過程中起到作用，本研究沒有進(jìn)一步深入，因此，下一步計(jì)劃添加不同濃度的亞硫酸鹽到菌株 X-3的降解培養(yǎng)基及胞外粗酶液中，檢測對(duì)角蛋白降解效率的影響。

為了進(jìn)一步挖掘該菌在降解角蛋白方面的潛能，還有許多的工作需要進(jìn)一步深入研究，如優(yōu)化該菌株的最佳產(chǎn)酶及降解角蛋白的環(huán)境條件、X-3降解角蛋白的分子機(jī)理也有待進(jìn)一步深入。

4 結(jié) 論

本研究篩選到一株高效的豬毛角蛋白降解菌株X-3，其對(duì)豬毛降解率高達(dá)77.3%。綜合菌株形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，初步鑒定該菌株為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。菌株X-3對(duì)α-角蛋白（豬毛、羊毛）和 β-角蛋白（雞毛、鵝毛、鴨毛）的降解率均大于 60%，是一株高效的廣譜角蛋白降解菌。菌株對(duì)豬毛角蛋白的降解依賴于其產(chǎn)生的角蛋白酶和二硫鍵還原酶活力的大小，在降解過程中產(chǎn)生了大量的可溶性蛋白，二硫鍵中的硫也隨之轉(zhuǎn)化為硫酸鹽、亞硫酸鹽和巰基化合物，表明菌株 X-3在利用角蛋白的過程中存在酶降解途徑，但是否具有亞硫酸鹽降解途徑有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本試驗(yàn)篩選的高效安全降解菌株 X-3可將豬毛角蛋白降解成易被動(dòng)物體消化利用的可溶性蛋白、多肽、氨基酸等產(chǎn)物，可用于廢棄豬毛角蛋白的資源化利用，具有廣闊的應(yīng)用潛力。