張瑞平 周聯(lián)東 王文潔 孫 佩 王 蕊 劉經緯 李和順 王學軍

（河南省新鄉(xiāng)市農業(yè)科學院，新鄉(xiāng)453000）

玉米雜交種和親本遺傳真實性是種子質量的重要標志之一，直接影響著玉米生產的產量和質量[1]。新品種逐年增加，高頻率使用骨干自交系使品種的遺傳基礎趨于狹窄，加大了品種鑒定的難度[2]。同工酶和蛋白電泳多態(tài)性不夠豐富，試驗條件要求嚴格，鑒定結果穩(wěn)定性低[3]，已經不能很好地鑒定種子的真實性和純度。SSR 標記因具有快速、準確、信息含量高、呈共顯性分離、易于分析、重復可靠等優(yōu)點，在分析自交系親緣關系[4-5]和雜交種純度[6-8]等方面發(fā)揮了重要作用。趙久然等[9]建立了46 個玉米自交系和雜交種的DNA 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，為更好地鑒定種子的純度和真實性提供了方便。

新科891 于2018 年通過國家農作物品種審定委員會審定，審定編號：國審玉20186115。本文利用SSR 分子標記技術，對新科891 及其親本進行分析，構建SSR-DNA 指紋圖譜，并將SSR 引物擴增的條帶數(shù)字化，計算出現(xiàn)相同數(shù)字指紋圖譜的概率，以期為更準確地鑒定該品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 雜交種新科891 及其父本PHA458和母本S155 均由河南省新鄉(xiāng)市農業(yè)科學院玉米課題提供。試驗所用DNA 聚合酶、dNTP 購買于寶生物工程（大連）有限公司。用于SSR 分析的56對引物序列來自玉米基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.maizegdb.org/ssr.php），由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取 將雜交種新科891 及其親本PHA458 和S155 種子沙培，置于30℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。3 葉1 心時取葉片混樣，用CTAB 的方法提取總DNA[10]，紫外分光光度計檢測DNA 的質量和濃度，加水稀釋至25ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 擴增體系及電泳分析 反應總體積為20μL，包 括dNTPs 0.2mmol/L、引 物0.25μmol/L 和 模 板DNA 25ng，加滅菌純水補足體積。PCR 擴增程序為：94℃預變性5min；94℃40s，60℃35s，72℃45s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR 擴增反應在BIOER TC-96/G/H（b）型PCR 儀上進行。在擴增產物中分別加入上樣緩沖液6×Loading Buffer，混勻后各取3.5μL 在8.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，凝膠通過銀染顯色。然后在膠片觀測燈上觀察電泳結果，用凝膠成像系統(tǒng)掃描圖片或者用相機拍照保存圖片。

1.2.3 指紋圖譜構建及數(shù)字化 篩選帶型清晰、穩(wěn)定的引物構建雜交種新科891 的指紋圖譜，并將指紋圖譜數(shù)字化。在相同遷移率位置（分子量相同片段）有帶記為1，無帶記為0，建立數(shù)據(jù)庫。根據(jù)公式P=1/2n計算相同指紋圖譜有可能出現(xiàn)的概率[1，11]，式中“2”為相同遷移率位點上等位基因存在的“有”或“無”（數(shù)字化處理中用1 或0 表示）兩種關系；“n”為等位基因的數(shù)目；2n為檢測n 個等位基因時有可能涉及的所有自交系的個數(shù)。

2 結果與分析

2.1 SSR 引物篩選 從56 對分布于玉米10 條染色體上的SSR 引物中篩選出擴增帶型穩(wěn)定、重復性好的7 對引物，用于構建雜交種新科891 的指紋圖譜，這7對引物分布在玉米的7 條染色體上，共檢測出23 個等位基因，每對引物可檢測出2～4 個等位基因，平均為3.29 個，片段大小在200～400bp 之間（表1）。

表1 用于構建新科891 指紋圖譜的引物信息

2.2 指紋圖譜構建 雜交種新科891 的指紋圖譜如圖1 所示，雜交種891 及其父母本由引物bnlg439w1、umc2007y4、umc2015k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg1702k1 以及phi0801k15 擴增的主條帶大小在200～400bp 之間。這7 對引物所擴出的雜交種新科891 的主條帶均是父本和母本主條帶的疊加，很好地印證了SSR 分子標記共顯性的遺傳特點[12]。

圖1 雜交種新科891 及其親本SSR 指紋圖譜

2.3 指紋圖譜數(shù)字化 將篩選出的7 對引物擴增的片段數(shù)字化，并計算出雜交種新科891 及其親本出現(xiàn)相同數(shù)字指紋圖譜的概率（表2），以父本PHA458 為例，數(shù)字指紋由23 個順序不同的數(shù)字構成，出現(xiàn)與其完全相同數(shù)字的概率為1.19×10-7（P=1/223），即在8.4×106（223）份自交系中，只有1 份自交系與上述指紋號碼相同。由此可見，出現(xiàn)與之完全相同數(shù)字指紋的概率極低，這個數(shù)字指紋圖譜是其特有的。同理，由這7 對引物構建的雜交種新科891 及其母本S155 的數(shù)字化指紋圖譜也是特有的，可用于品種的真實性和純度鑒定。

表2 新科891 及其親本的數(shù)字化指紋圖譜

3 結論

相對于其他標記，SSR 標記比較穩(wěn)定并且隨機性更強，能提供更多的遺傳信息。同時SSR 標記檢測簡便、快捷，又是共顯性標記，所以越來越多的應用在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、自交系系譜研究、雜交優(yōu)勢群和DNA 指紋圖譜建立上[1]。本研究針對雜交種新科891 及其父母本，利用SSR 分子標記，從56 對引物中篩選出7 對重復性及穩(wěn)定性好、帶型清晰的引物，用于構建新科891 及其親本的指紋圖譜，并且將擴出的條帶數(shù)字化，建立雜交種新科891 及其親本的數(shù)字指紋圖譜，計算出現(xiàn)相同指紋的概率均為1.19×10-7，概率極低。因此，這7 對引物構建的雜交種新科891 的指紋圖譜是特有的，在生產上可隨機選擇1～2 對引物用于雜交種新科891純度和真實性鑒定，可操作性強。