王 琴， 嚴(yán)夢(mèng)楠， 宋一祎， 李華茵

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200032

侵襲性肺曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)是嚴(yán)重的機(jī)會(huì)性感染性疾病，多見(jiàn)于免疫抑制宿主，如血液系統(tǒng)惡性腫瘤、器官移植患者。盡管廣譜抗真菌藥物不斷發(fā)展，IPA患者死亡率還是居高不下[1]。近年來(lái)，非粒細(xì)胞缺乏患者中IPA的報(bào)道越來(lái)越多，如慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)患者[2-3]。Guinea等[4]發(fā)現(xiàn)，約1.63%的住院COPD患者下呼吸道分泌物中可分離出曲霉菌，其中約22.1%擬診IPA。COPD住院患者繼發(fā)IPA多與系統(tǒng)性應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、廣譜抗生素及機(jī)械通氣相關(guān)。

2007年，Bulpa等[3]提出COPD患者IPA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，分為確診、擬診、疑診和定植。其中，確診有賴(lài)于組織病理學(xué)檢查；擬診患者要求臨床依據(jù)(COPD患者近期因急性加重住院，胸部影像學(xué)提示曲霉菌感染，對(duì)常規(guī)抗感染治療無(wú)反應(yīng))和病原學(xué)依據(jù)[下呼吸道分泌物分離出曲霉菌或者連續(xù)2次血清半乳甘露聚糖(GM)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性]；疑診患者缺乏病原微生物依據(jù)；定植為患者缺乏臨床表現(xiàn)但下呼吸道分泌物分離出曲霉菌。2016年美國(guó)感染病學(xué)會(huì)(Infectious Diseases Society of America, IDSA)更新了曲霉菌病診治指南，強(qiáng)調(diào)分子生物學(xué)技術(shù)的診斷價(jià)值[5]。

大部分COPD住院患者因肺功能差、喘息、機(jī)械通氣等原因，不能耐受氣管鏡、經(jīng)皮肺活檢等有創(chuàng)性檢查，確診IPA困難。常規(guī)的痰液培養(yǎng)方法耗時(shí)長(zhǎng)、陽(yáng)性率低，不能為快速診斷提供幫助。而分子生物學(xué)技術(shù)，如熒光定量PCR，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速檢測(cè)的特點(diǎn)，可為臨床快速診斷提供重要幫助。因此，本研究采用前瞻性觀察性研究，通過(guò)收集住院COPD患者的痰液，多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法檢測(cè)其中的曲霉菌，探索PCR檢測(cè)痰液曲霉菌在COPD患者合并IPA中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入選標(biāo)準(zhǔn)：入選2015年4月至2017年3月因COPD急性加重入住復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院的患者，其均有常規(guī)痰液真菌培養(yǎng)標(biāo)本。本研究通過(guò)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批件號(hào)碼：B2016-104)。由于收集患者常規(guī)痰曲霉菌培養(yǎng)剩余的痰液為無(wú)創(chuàng)傷性，故免簽署患者知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：COPD僅作為次要診斷的住院患者。收集患者的一般資料，真菌感染危險(xiǎn)因素(糖皮質(zhì)激素使用情況、廣譜抗生素使用情況、機(jī)械通氣等)，臨床癥狀，影像學(xué)表現(xiàn)，病原學(xué)檢查結(jié)果，血清半乳甘露聚糖(GM)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，血清1,3-β-D葡聚糖(G)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2 PCR法檢測(cè)痰液曲霉菌 收集患者常規(guī)痰真菌培養(yǎng)后剩余痰液，放置于無(wú)菌痰杯中，進(jìn)行DNA提取及多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)。檢測(cè)步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)(翔瓊生物)進(jìn)行。

1.2.1 DNA抽提 取200 μL痰液，置于1.5 mL離心管，加入5倍體積的試劑A，振蕩30 s，室溫放置20 min；12 000 r/min(r=6 cm)離心5 min，棄上清，沉淀用1 000 μL 試劑B充分懸浮，12 000 r/min(r=6 cm)，離心5 min，小心棄除上清，留沉淀；沉淀加25 μL試劑C和25 μL試劑D，充分懸浮，振蕩15 s；將離心管置于水浴鍋，37℃，60 min；離心管置于水浴鍋，80℃，15 min；取出離心管，6 000 r/min(r=6 cm)，離心5 min；取1 μL上清作為PCR模板。

1.2.2 PCR反應(yīng) 配制20 μL PCR反應(yīng)體系：2×Taqman酶反應(yīng)液10 μL，3.3×煙曲霉檢測(cè)反應(yīng)液6 μL，DNA模板或陰(陽(yáng))性對(duì)照品1 μL，無(wú)菌水3 μL。將反應(yīng)液混勻，2 000 r/min(r=6 cm)離心15 s，使所加試劑聚集到管底；PCR擴(kuò)增。將PCR反應(yīng)板放入熒光定量PCR儀器中，反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。信號(hào)收集：第2階段60℃時(shí)收集熒光基團(tuán)FAM，參比熒光為ROX。

1.2.3 結(jié)果質(zhì)控 陰性對(duì)照的Ct值均應(yīng)等于40；陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于或等于35，并有較好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)曲線(xiàn)。否則，視為此次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。結(jié)果判讀：被檢樣品的Ct值小于35并有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)曲線(xiàn)為陽(yáng)性結(jié)果；被檢樣品的Ct值等于35時(shí)，有對(duì)數(shù)生長(zhǎng)曲線(xiàn)為陽(yáng)性，無(wú)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)曲線(xiàn)為陰性結(jié)果；被檢樣品的Ct值大于35時(shí)，無(wú)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)曲線(xiàn)為陰性，有較好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)曲線(xiàn)時(shí)加大樣本量重做，重做結(jié)果同前，則判為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2008年歐洲癌癥研究和治療組織(European Organization for Research and Treatment of Cancer, EORTC)/真菌病研究組(Mycoses Study Group, MSG；EORTC/MSG)和2016年IDSA曲霉病診斷臨床實(shí)踐指南，將曲霉菌病分為確診、擬診和疑診。確診需要組織病理學(xué)依據(jù)或正常無(wú)菌部位標(biāo)本曲霉菌培養(yǎng)陽(yáng)性；擬診患者需符合1項(xiàng)宿主因素、1項(xiàng)臨床依據(jù)和1項(xiàng)微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)；疑診患者須符合1項(xiàng)宿主因素和1項(xiàng)臨床依據(jù)，而缺乏生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)性和方差齊性的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 49例COPD患者中，18例診斷為IPA，其中確診4例、臨床診斷(擬診+疑診)14例。合并IPA的COPD組患者系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和廣譜抗生素比例高于不合并組(表1)。

2.2 臨床特征對(duì)比 結(jié)果(表2)表明：與不合并IPA組患者相比，合并IPA組COPD患者發(fā)熱更常見(jiàn)；兩組呼吸系統(tǒng)癥狀差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。合并IPA組患者胸部CT結(jié)節(jié)、空洞更多見(jiàn)，不合并IPA組患者胸部CT多無(wú)特殊陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)。

表1 COPD住院患者的一般資料

表2 兩組患者臨床特征的對(duì)比

2.3 病原學(xué)檢查結(jié)果

2.3.1 G和GM檢測(cè) 18例合并IPA的COPD患者中，15例患者進(jìn)行了血清G實(shí)驗(yàn)，其中陽(yáng)性2例、陰性13例；31例不合并IPA的COPD患者中，18例檢測(cè)了血清G實(shí)驗(yàn)，陽(yáng)性8例、陰性10例。血清G實(shí)驗(yàn)對(duì)于COPD患者IPA診斷的敏感性和特異性分別為13.3%(95%CI 2.3～41.6)、55.5%(95%CI 31.3～77.5)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為20%(95%CI 3.5～55.7)、43.4%(95%CI 23.8～65.1)。49例患者中僅7例患者進(jìn)行了血清GM實(shí)驗(yàn)，病例數(shù)太少，未進(jìn)一步計(jì)算GM實(shí)驗(yàn)對(duì)COPD患者IPA診斷的敏感性及特異性。

2.3.2 痰曲霉菌培養(yǎng) 49例患者均進(jìn)行了痰液曲霉菌培養(yǎng)檢測(cè)。18例合并IPA的COPD患者中，陽(yáng)性6例、陰性12例。31例不合并IPA的COPD患者中，陽(yáng)性2例、陰性29例。痰液真菌培養(yǎng)診斷COPD患者IPA的敏感性及特異性分別為33.3%(95%CI 14.3～58.8)和93.5%(95%CI 77.1～98.8)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為75%(95%CI 35.5～95.5)和70.7%(95%CI 54.2～83.3)。

2.3.3 熒光定量PCR檢測(cè)痰曲霉菌 49例患者均進(jìn)行痰液熒光定量PCR以檢測(cè)曲霉菌。18例合并IPA的COPD患者中，陽(yáng)性13例、陰性5例。31例不合并IPA的COPD患者中，陽(yáng)性4例、陰性27例。熒光定量PCR檢測(cè)痰液中曲霉菌診斷COPD患者合并IPA的敏感性及特異性分別為72.2%(95%CI 46.4～89.2)和87.1%(95%CI 69.2～95.7)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為76.5%(95%CI 49.8～92.2)和84.4%(95%CI 66.4～94.1)。

3 討 論

COPD患者IPA的發(fā)生率報(bào)道并不一致，為1%～9%[4,6-7]。全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素在住院COPD患者發(fā)生IPA中有促進(jìn)作用。研究[5]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用強(qiáng)的松日劑量大于20 mg或累計(jì)劑量大于700 mg的患者IPA的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加；亦有研究[8]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期吸入糖皮質(zhì)激素增加COPD患者IPA的風(fēng)險(xiǎn)。本研究得出類(lèi)似結(jié)論，在合并IPA的COPD患者中，88.9%的患者全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素；而在不合并IPA的COPD患者，僅25.8%的患者全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素。吸入糖皮質(zhì)激素在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他有意義的危險(xiǎn)因素還包括廣譜抗生素的應(yīng)用。而合并其他基礎(chǔ)疾病如糖尿病、心血管疾病、低蛋白血癥等在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與不合并IPA的COPD患者相比，合并IPA的COPD患者臨床特征以發(fā)熱更常見(jiàn)，胸部CT以多發(fā)結(jié)節(jié)伴空洞更多見(jiàn)，而既往研究[3]結(jié)果提示其以浸潤(rùn)實(shí)變影多見(jiàn)，可能與本研究樣本量小有關(guān)。

COPD患者合并IPA的診斷率低，組織病理學(xué)是目前最可靠的診斷方法。但因住院COPD患者肺功能差，氣急明顯，難以耐受氣管鏡及肺穿刺等有創(chuàng)檢查，從而導(dǎo)致確診率低，多依賴(lài)于臨床診斷。本研究中18例診斷為IPA的患者中，僅4例患者接受了氣管鏡檢查，得到臨床確診，其余14例均為臨床診斷。病原微生物學(xué)依據(jù)在COPD患者IPA的診斷中具有至關(guān)重要的價(jià)值。1,3-β-D葡聚糖是大部分真菌細(xì)胞壁組成成分(接合菌、隱球菌除外)，故其陽(yáng)性并不代表一定為曲霉菌感染。G實(shí)驗(yàn)在診斷真菌感染中的敏感性和特異性分別為77%、85%[9]。本研究中18例患者檢測(cè)了血清G實(shí)驗(yàn)，陽(yáng)性8例、陰性10例。血清G實(shí)驗(yàn)對(duì)于COPD患者IPA診斷的敏感性和特異性分別為13.3%、55.5%，顯著較低，可能與病例數(shù)較少、采樣時(shí)間及多數(shù)患者經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用抗真菌藥物有關(guān)。半乳甘露聚糖是曲霉菌細(xì)胞壁上的多聚抗原，與G實(shí)驗(yàn)相比，GM實(shí)驗(yàn)對(duì)曲霉菌病的診斷有較高的特異性。文獻(xiàn)[10]報(bào)道，GM實(shí)驗(yàn)的敏感性和特異性分別為61%～89%和84%～95%。COPD患者肺泡灌洗液中GM實(shí)驗(yàn)的診斷價(jià)值與粒細(xì)胞缺乏患者血清GM實(shí)驗(yàn)的診斷價(jià)值相似。但本研究?jī)H7例患者進(jìn)行了GM實(shí)驗(yàn)，故未予進(jìn)一步探討GM實(shí)驗(yàn)的診斷價(jià)值。

痰液曲霉菌培養(yǎng)簡(jiǎn)便，易獲取。在COPD患者痰液中分離出曲霉菌，尤其是反復(fù)分離獲得時(shí)，需要進(jìn)一步完善胸部CT檢查，評(píng)估IPA的可能性。本研究所有病例均進(jìn)行了痰液曲霉菌培養(yǎng)，痰液真菌培養(yǎng)對(duì)COPD患者IPA診斷的敏感性及特異性分別為33.3%、93.5%，特異性較高，但敏感性低，且痰曲霉菌培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，至少需要3 d，不利于IPA早期診斷。

熒光定量PCR檢測(cè)曲霉菌方法快速、敏感性高，多在粒細(xì)胞缺乏患者中開(kāi)展研究，肺泡灌洗液PCR檢測(cè)的敏感性高于血清中PCR檢測(cè)[11]。由于不同文獻(xiàn)中描述的方法各不相同，缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，IDSA 2016年指南尚未推薦PCR檢測(cè)方法常規(guī)用于臨床診斷[6]。IDSA 2016指南建議臨床醫(yī)師根據(jù)個(gè)體情況謹(jǐn)慎選擇PCR作為IPA的診斷。臨床醫(yī)師須根據(jù)PCR試劑盒的方法學(xué)和檢測(cè)特點(diǎn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行解讀。使用PCR方法診斷IPA，應(yīng)結(jié)合其他診斷方法和臨床情況。目前，關(guān)于痰液PCR檢測(cè)的研究較少。本研究熒光定量PCR檢測(cè)痰液中的曲霉菌診斷COPD患者合并IPA的敏感性及特異性分別為72.2%、87.1%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為76.5%、84.4%。敏感性顯著高于常規(guī)培養(yǎng)方法，但特異性較痰曲霉菌培養(yǎng)略低，可能與檢測(cè)敏感性高有關(guān)。

綜上所述，COPD患者中發(fā)生IPA并不少見(jiàn)，多見(jiàn)于全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及廣譜抗生素的患者。該病確診困難，多依賴(lài)于臨床診斷，熒光定量PCR檢測(cè)痰液中的曲霉菌在COPD合并IPA的診斷中的敏感性和特異性均較高，能為臨床早期診斷提供重要的價(jià)值。但本研究選擇的痰液標(biāo)本易污染，無(wú)法區(qū)分定植與感染，且未同時(shí)檢測(cè)血清及肺泡灌洗液，有待在后續(xù)研究中加以補(bǔ)充。