滕 偉， 鄭先杰， 鞏貴宏， 何兆輝， 張君毅， 惠學(xué)志

河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，開封 475001

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)可根據(jù)其在基因組中的位置分為正義lncRNA(sense lncRNA)、反義lncRNA(antisense lncRNA)、雙向lncRNA(bidirectinal lncRNA)、基因內(nèi)lncRNA(intronic lncRNA)和基因間lncRNA(intergenic lncRNA，又稱lincRNA)5種類型。其中，linc00152在肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞中起轉(zhuǎn)錄因子的作用[1]。而在胃癌細(xì)胞中，linc00152可起到信號傳導(dǎo)或支架作用。 RNA降低和RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)[2]顯示，linc00152可直接與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)結(jié)合并激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)。

miR-4767最早被發(fā)現(xiàn)于乳腺癌[3]。最近一項(xiàng)研究[4]證實(shí)Bcl2L12和EGFR都是miR-4767的靶基因，并證實(shí)miR-4767通過靶向抗凋亡基因Bcl2L12參與人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)的凋亡過程。然而，miR-4767在HUVEC遷移中的作用機(jī)制尚不明確。

因此，本研究通過過表達(dá)或阻斷l(xiāng)inc00152及miR-4767，檢測linc00152對經(jīng)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)處理的HUVEC凋亡、遷移的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和ox-LDL處理 HUVEC購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，HEK293T細(xì)胞購自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。將HUVEC置于含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和 100 mg/mL鏈霉素的DMEM中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育。將HUVEC以105個(gè)/孔接種于12孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)50%時(shí)，將ox-LDL[溶于含有 0.08 μmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)的磷酸鹽緩沖液(PBS)]以50、100、150、200 μg/mL分別加入細(xì)胞中，分別標(biāo)記培養(yǎng)24 h。對照組用含0.08 μmol/L EDTA-Na2的等體積PBS培養(yǎng)細(xì)胞24 h。

1.2 載體轉(zhuǎn)染 用陽離子脂質(zhì)體lipofectamine 3000(Invitrogen公司)分別轉(zhuǎn)染含或不含全長linc00152序列的pcDNA3.1、linc00152 siRNA(silinc00152)、miR-4767模擬物、miR-4767拮抗劑及混雜的陰性對照寡核苷酸。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 采用Trizol試劑盒(Invitrogen公司)提取細(xì)胞的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript Ⅲ試劑盒(Invitrogen公司)合成cDNA。用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]以25 μL的終體積進(jìn)行qRT-PCR，并通過iQ5TM多色實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad公司)監(jiān)測反應(yīng)過程。反應(yīng)條件如下：95℃ 1 min；94℃ 15 s、54℃ 30 s、72℃ 20 s，共35個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2-ΔΔCt方法計(jì)算所有測試基因的轉(zhuǎn)錄濃度(以U6作為內(nèi)參)。反應(yīng)中使用的引物由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)和合成。

1.4 蛋白質(zhì)印跡 將蛋白樣品定量后，計(jì)算出含30 μg蛋白質(zhì)的樣品量，用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目標(biāo)蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至0.22 μm PVDF膜(Millipore公司)。轉(zhuǎn)膜后，用以下抗體4℃孵育過夜：抗-Bcl2L12(1∶500，Abcam公司)，EGFR抗體(1∶500，Abcam公司)，抗-PI3K(1∶400，CST公司)，抗-p-PI3K(1∶200，CST公司)，抗半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶7(抗Caspase -7，1∶300，Abcam公司)，抗β-肌動(dòng)蛋白(1∶800，Abcam公司)。 用相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記法孵育后，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)蛋白質(zhì)印跡試劑盒(Millipore公司)及凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)分析。

1.5 linc00152與HUVEC的熒光原位雜交 采用FISH試劑盒(Roche公司)檢測linc00152的亞細(xì)胞定位。收集HUVEC，洗滌2次，并用4%多聚甲醛固定，加入雜交溶液及地高辛標(biāo)記的linc00152探針；探針作為陰性對照。細(xì)胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司)室溫染色10 min。用冷PBS重復(fù)沖洗2次后，在共聚焦激光掃描顯微鏡(FV 1000，Olympus公司)下觀察。

1.6 HUVEC凋亡和遷移檢測 重組載體轉(zhuǎn)染HUVEC 48 h后，用ox-LDL處理HUVEC，檢測HUVEC的凋亡與遷移情況。采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒(Roche公司)，通過計(jì)算雜交后12個(gè)培養(yǎng)孔中共計(jì)1 000個(gè)細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)來定量各轉(zhuǎn)染組凋亡情況。采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移情況。

1.7 熒光素酶報(bào)道重組子構(gòu)建和活性檢測 分別采用野生型(WT)Bcl2L12 3’UTR、EGFR 3’UTR擴(kuò)增linc00152序列。使用QuikChange Ⅱ XL定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene公司)誘導(dǎo)linc00152序列突變(MUT)。將WT序列(含miR-4767結(jié)合位點(diǎn))和MUT(缺乏miR-4767結(jié)合位點(diǎn))序列分別亞克隆到螢光素酶基因編碼區(qū)下游的Dual-Glo Dual-Luciferase載體(Promega公司)中。將HEK293T細(xì)胞以3×104個(gè)/孔接種到24孔板中，細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)，將細(xì)胞與雙熒光素酶(螢火蟲和海腎熒光素酶)報(bào)道重組子和mi-4767模擬物或NC寡核苷酸與Lipofectamine 3000共轉(zhuǎn)染48 h。通過Multi-label測量螢火蟲或海腎螢光素酶活性(讀板器：VICTORTM X2，PerkinElmer公司)，標(biāo)準(zhǔn)化螢光素酶活性。

1.8 生物素化miR-4767的測定 用生物素化的miR-4767-WT/MUT轉(zhuǎn)染HUVEC 48 h后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌，離心；用裂解緩沖液(Ambion公司)中裂解10 min，將其中50 mL裂解物等分。余裂解物與RNase-free離心管、酵母tRNA(Sigma公司)、鏈親和素包被磁珠(Dynal Biotech公司)于4℃下孵育3 h，冷裂解緩沖液洗滌2次，低鹽緩沖液洗滌3次，高鹽緩沖液洗滌1次；經(jīng)Trizol純化后，對HUVEC內(nèi)的外源linc00152進(jìn)行qRT-PCR分析。

2 結(jié) 果

2.1 linc00152與HUVEC的原位雜交結(jié)果 RNA-FISH法結(jié)果(圖1)顯示：linc00152主要位于HUVEC的細(xì)胞質(zhì)中；與免疫球蛋白G(IgG)免疫沉淀物相比，linc00152在富含Ago2的miRNA-核糖核蛋白復(fù)合物(miRNP)中的含量更高。

圖1 linc00152的熒光原位雜交結(jié)果

A：linc00152定位于HUVEC的細(xì)胞質(zhì)，反義探針作陰性對照；B：相比IgG，linc00152在富含Ago2的miRNP中含量更高. Original magnification：×400.**P<0.01

2.2 ox-LDL處理的HUVEC中l(wèi)inc00152與miR-4767的相互作用 linc00152上具有結(jié)合的miR-4767的位點(diǎn)，結(jié)合自由能低(圖2)。圖3顯示W(wǎng)T和MUT linc00152螢光素酶報(bào)道重組子。

圖2 linc00152與miR-4767的內(nèi)源性結(jié)合

A：linc00152序列中miR-4767靶向的潛在位點(diǎn)；B：miR-4767結(jié)合linc00152的自由能

圖3 linc00152插入螢光素酶報(bào)道基因載體

結(jié)果(圖4)顯示：miR-4767抑制luc-linc00152-WT的熒光素酶活性(P<0.01)，不影響luc-linc00152-MUT的活性。生物素化的miR-4767-WT探針使HUVEC中l(wèi)inc00152的表達(dá)增加(P<0.01)，生物素化的miR-4767-MUT探針無此影響。linc00152過表達(dá)、敲減48 h后，HUVEC中miR-4767的水平分別下降、升高(P<0.01)；miR-4767模擬物、RNA拮抗劑轉(zhuǎn)染HUVEC后，linc00152表達(dá)分別減少、增加(P<0.05)。

2.3 linc00152可能通過miR-4767影響HUVEC凋亡與遷移 結(jié)果(圖5)顯示：miR-4767增加HUVEC的凋亡，抑制HUVEC的遷移(P<0.05)；linc00152引起的HUVEC的凋亡與遷移的變化與之相反(P<0.05)。

2.4 linc00152可能通過miR-4767影響B(tài)cl2L12及EGFR表達(dá) 結(jié)果(圖6)顯示：miR-4767可直接靶向Bcl2L12及EGFR。miR-4767抑制luc-EGFR-WT的熒光素酶活性(P<0.01)，對luc-EGFR-MUT沒有明顯影響；miR-4767以劑量依賴性方式負(fù)向調(diào)節(jié)Bcl2L12和EGFR的表達(dá)(P<0.05)。linc00152正向調(diào)節(jié)Bcl2L12、EGFR及PI3K的表達(dá)，負(fù)向調(diào)節(jié)caspase-7的表達(dá)(P<0.01)。

圖4 經(jīng)ox-LDL處理的HUVEC中l(wèi)inc00152與miR-4767的相互作用

圖5 MiR-4767及l(fā)inc00152對經(jīng)ox-LDL處理的HUVEC凋亡和遷移的影響

2.5 阻斷miR-4767后linc00152對HUVEC凋亡與遷移的影響 結(jié)果(圖5B，圖6F)表明：阻斷miR-4767后，linc00152敲減引起的HUVEC凋亡增加與遷移減少的作用被減弱；同時(shí)，linc00152敲減引起的Bcl2L12、EGFR及PI3K表達(dá)降低，caspase-7表達(dá)升高的作用被改善。

3 討 論

LncRNA與心血管疾病有著密切關(guān)系，但目前對lncRNA的研究尚處于起步階段。心肌梗死與lncRNA的關(guān)系在最近的一項(xiàng)來自基因芯片的實(shí)驗(yàn)[5]中得到證實(shí)。在心肌梗死鼠中，有20個(gè)lncRNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)上調(diào)，10個(gè)lncRNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)下調(diào)。其中，心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MIRT1)表達(dá)上調(diào)5倍，MIRT2表達(dá)上調(diào)13倍。另一個(gè)心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本lncRNA MIAT[6]也被發(fā)現(xiàn)，說明lncRNA與心肌梗死的發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)系，且參與了血管的病理性發(fā)生。

LncRNA功能相關(guān)機(jī)制可能包括：(1)基因印記，如對脊椎動(dòng)物發(fā)育過程中的H19[7]、在X染色體失活中的X染色體特異性失活復(fù)合物(Xist)[8]的作用；(2)染色質(zhì)重塑，如lncRNA對骨架分子HOTAIR的作用[9]；(3)細(xì)胞周期調(diào)控，如其對哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長、凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子生長阻滯特異轉(zhuǎn)錄物5(Gas5)表達(dá)的影響[10]；(4)剪接調(diào)控，如其對多種癌癥中異常表達(dá)的肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(MALAT1)[11]的調(diào)控；(5)mRNA降解，如一種被稱為半Stau1結(jié)合位點(diǎn)RNA(1/2-sbsRNA)的lncRNA通過與mRNA的3’UTR的Alu元件的不完全配對，形成Stau1結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)Stau1與mRNA相結(jié)合，引起mRNA降解[12]；(6)翻譯調(diào)控，如在缺少人類抗原R(HuR)細(xì)胞中的lincRNA-p21可結(jié)合蛋白，在細(xì)胞中穩(wěn)定存在并不斷積累，與靶mRNA結(jié)合后抑制mRNA的翻譯[13]。

圖6 miR-4767對Bcl2L12和EGFR基因的作用

血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell, VEC)可同時(shí)分泌一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素，兩者相互制約，共同參與控制血流量、調(diào)節(jié)血流速度及調(diào)節(jié)血管張力。VEGF由VEC分泌，具有多重生理作用，如開放側(cè)支循環(huán)和直接誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖等。He等[14]在SVEC4血管內(nèi)皮lncRNA-p21過表達(dá)和敲除的小鼠中發(fā)現(xiàn)，敲除lncRNA-p21后，VEC增殖增加、凋亡減少，過表達(dá)lncRNA-p21后則VEC凋亡增加、增殖減少；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-130b對減少VEC增殖的作用是通過被lncRNA-p21競爭性結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。除此之外，lncRNA LOC 100129973靶向處理miR-4767及miR-4707-5p后，VEC凋亡被抑制[15]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與miR-9的表達(dá)通過lncRNA HULC調(diào)節(jié)，影響VEC凋亡[16]。VEC的增殖在lncRNA H19被敲除后停留在G1期，導(dǎo)致其形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力降低[17]。Michalik等[18]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮缺氧時(shí)，lncRNA MALAT1的表達(dá)明顯增加；內(nèi)皮增殖在體內(nèi)敲除及體外沉默MALAT1后減少；MALAT1被藥物抑制后，下肢毛細(xì)血管密度降低，表現(xiàn)為缺血后血流恢復(fù)速度減慢[19]

目前，lncRNA相關(guān)研究還處于起步階段，對lncRNA的功能及相關(guān)機(jī)制的認(rèn)識仍較局限，且僅很少的lncRNA被鑒定具有功能。但隨著相關(guān)lncRNA數(shù)據(jù)庫的建立與充實(shí)、生物信息技術(shù)的進(jìn)步、基因芯片技術(shù)及高通量lncRNA表達(dá)分析技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，lncRNA將會(huì)不斷被認(rèn)識，進(jìn)而為診治心血管系統(tǒng)疾病、完整認(rèn)識預(yù)防心血管病提供理論依據(jù)。

本研究在linc00152過表達(dá)或敲減并用ox-LDL處理HUVEC中發(fā)現(xiàn)，miR-4767水平降低或升高，提示Linc00152可能通過與miR-4767的內(nèi)源性結(jié)合發(fā)揮作用。Linc00152可能通過miR-4767靶向Bcl2L12和EGFR抑制HUVEC凋亡和促進(jìn)其遷移；而阻斷miR-4767后可改善由linc00152敲減引起的Bcl2L12和EGFR的減少，進(jìn)而改善linc00152敲減對HUVEC凋亡和遷移的影響。本研究提示，linc00152可能成為改善血管內(nèi)皮功能和治療部分心血管疾病的潛在靶點(diǎn)。