童 琳， 常美佳， 胡 潔， 周 建， 白春學(xué)

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科，上海市呼吸病研究所，上海 200032

近年來，隨著對肺癌發(fā)病機(jī)制研究的進(jìn)一步深入，新興的治療手段不斷涌現(xiàn)，使得晚期肺癌患者的預(yù)后得到較大改善。然而，老年晚期肺癌患者常無法耐受放化療、靶向等治療引起的不良反應(yīng)。因此，應(yīng)用不良反應(yīng)小而有良好免疫增強(qiáng)和抗腫瘤作用的藥物是晚期肺癌治療的理想手段。

槐耳是生長在中國古槐樹上的一種天然菌，1 500余年前已作為藥物治療多種疾病。槐耳清膏是槐耳菌質(zhì)的提取物，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性、提高免疫細(xì)胞殺傷能力、抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力等多靶位抗腫瘤功效[1]。體外研究[2]發(fā)現(xiàn)，槐耳清膏能誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)肺腺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性，增強(qiáng)順鉑的化療作用。本研究通過探討槐耳清膏對裸鼠肺癌移植瘤的抑瘤作用，分析其對肺癌的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材 料 槐耳清膏制劑由啟東蓋天力藥業(yè)有限公司提供。將槐耳清膏溶于0.9% NaCl溶液，分別制成100、300、500、700 mg/mL的含藥溶液，用于槐耳清膏組裸鼠灌胃。SPF級裸鼠由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中心實驗室提供，雄性25只，鼠齡4～6周。

1.2 動物實驗 將PC9R肺癌細(xì)胞等量(1×107)接種到25只裸鼠皮下，待接種14 d接種部位腫瘤長出后，將其隨機(jī)分為5組，每組5只(實驗過程中有裸鼠死亡情況，因此實驗終點取瘤體時每組裸鼠為4～5只)。第1組每3 d給予槐耳清膏1 g/kg；第2組每3 d給予槐耳清膏3 g/kg；第3組每3 d給予槐耳清膏5 g/kg；第4組每3 d給予槐耳清膏7 g/kg；對照組每3 d給予0.9% NaCl溶液0.2 mL。接種前、接種14 d后以及給藥期間每周稱裸鼠體質(zhì)量。喂養(yǎng)3周后頸椎脫臼處死，完整取出瘤體，比較各組瘤重和瘤體積，計算抑瘤率。抑瘤率的計算方法如下：用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最長徑(a)和最短徑(b)，腫瘤體積V=ab2/2；腫瘤相對體積(RTV)=某時間點腫瘤體積/分組時腫瘤體積；抑瘤率=(1-RTV槐耳清膏組/RTV對照組)×100%。

1.3 組織病理學(xué)檢查 腫瘤組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚5 μm，進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅(H-E)染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織的病理學(xué)改變。腫瘤組織經(jīng)Ki-67(DAKO公司提供)免疫組化染色，計算腫瘤組織Ki-67陽性細(xì)胞比率。

2 結(jié) 果

2.1 槐耳清膏對裸鼠皮下接種肺癌細(xì)胞成瘤的影響 25只裸鼠在接種PC9R肺癌細(xì)胞14 d后，接種部位均長出腫瘤，其他部位和器官均未見腫瘤生長。對腫瘤生長的抑制作用以槐耳清膏5 g/ kg和7 g/kg劑量組的作用較強(qiáng)，槐耳清膏3 g/kg組和1 g/kg組較弱。其中，5 g/kg體質(zhì)量(P=0.004 4)和7 g/kg劑量組(P=0.021 5)抑瘤率與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)；槐耳清膏7 g/kg組與5 g/kg組抑瘤率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。喂養(yǎng)3周后取出移植瘤，稱重，顯示槐耳清膏5 g/kg組瘤重較對照組降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

表1 槐耳清膏對裸鼠肺癌的抑瘤率

**P<0.01，*P<0.05與對照組相比

圖1 槐耳清膏對裸鼠肺癌移植瘤質(zhì)量的影響

2.2 槐耳清膏對皮下接種肺癌裸鼠體質(zhì)量的影響 分別于種瘤前、種瘤后14 d、喂養(yǎng)期間每周稱裸鼠體質(zhì)量，結(jié)果(圖2)顯示：對照組裸鼠體質(zhì)量在喂養(yǎng)前2周逐步增長，在喂養(yǎng)第3周較前有所減輕；槐耳清膏3 g/kg、5 g/kg和7 g/kg組裸鼠體質(zhì)量在喂養(yǎng)第3周仍呈增長趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 槐耳清膏對肺癌移植瘤裸鼠體質(zhì)量的影響

1：種瘤前；2：種瘤后14 d；3：給藥1周后；4：給藥2周后；5：給藥3周后

2.3 槐耳清膏對裸鼠皮下接種肺癌細(xì)胞的組織病理學(xué)影響 H-E染色結(jié)果(圖3)顯示：對照組腫瘤細(xì)胞生長旺盛，有異型性，形態(tài)不規(guī)則，大小不等，細(xì)胞核大、濃染，可見病理性核分裂相，無明顯壞死區(qū)。槐耳清膏組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不同程度退行性變，局部出現(xiàn)缺血壞死區(qū)，壞死灶周圍可見殘存腫瘤細(xì)胞。

圖3 槐耳清膏對裸鼠肺癌腫瘤組織病理的影響(H-E染色)

A：對照組；B：槐耳清膏5 g/kg組. Original magnification: ×200

2.4 槐耳清膏對裸鼠皮下接種肺癌細(xì)胞的增殖指數(shù)影響 對肺癌移植瘤組織進(jìn)行Ki-67免疫組化染色，結(jié)果(圖4)顯示：槐耳清膏3、5、7 g/kg組腫瘤細(xì)胞Ki-67陽性率均較對照組下降，其中7 g/kg組Ki-67陽性率最低(24.8%，P<0.001)，提示槐耳清膏對腫瘤細(xì)胞增殖活性有明顯抑制作用。

圖4 槐耳清膏對裸鼠肺癌腫瘤細(xì)胞Ki-67陽性率的影響

1：對照組；2：槐耳清膏1 g/kg；3：槐耳清膏3 g/kg；4：槐耳清膏5 g/kg；5：槐耳清膏7 g/kg. Original magnification: ×200.**P<0.01，*P<0.05與對照組相比

3 討 論

肺癌已成為全球癌癥相關(guān)死亡的首要病因，其死亡率占惡性腫瘤死亡率的第1位。目前肺癌的治療采用以外科手術(shù)為主的綜合療法，但有一半以上的肺癌患者確診時已是晚期，失去手術(shù)機(jī)會，可供選擇的方案為化療、放療、靶向治療、免疫治療等的綜合治療，但總體預(yù)后仍欠佳，并且治療的不良反應(yīng)較大，較多患者無法耐受。因此，尋找對肺癌治療有效而人體不良反應(yīng)小的藥物，一直是肺癌治療的研究熱點。槐耳清膏是槐耳菌質(zhì)經(jīng)熱水提取物，含有多種有機(jī)成分，10余種礦物質(zhì)元素。槐耳多糖蛋白是槐耳清膏的主要活性成分，由6個單糖結(jié)合18種氨基酸組成，是一種活性很高的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑?；倍甯嗑哂姓T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，提高免疫細(xì)胞殺傷能力，抑制腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力等多重抗腫瘤功效[1]。槐耳清膏對正常細(xì)胞幾乎沒有損害。目前槐耳清膏已被制成槐耳顆粒應(yīng)用于臨床，對肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、食管癌等腫瘤都有明顯療效[1]。小樣本的臨床研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，槐耳能延長晚期肺癌患者的生存期，改善其生活質(zhì)量和免疫功能。

既往研究[6]顯示，槐耳對體外培養(yǎng)的人大細(xì)胞肺癌L9981具有劑量依賴性的生長抑制作用，其機(jī)制可能與調(diào)控血管生成相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)?；倍幚砗蟮姆伟〢549細(xì)胞miRNA基因芯片檢測結(jié)果顯示，有66個miRNA異常表達(dá)，其中miR-26b-5p上調(diào)可抑制肺癌細(xì)胞A549增殖，誘導(dǎo)其凋亡，而特異性的抑制劑可逆轉(zhuǎn)槐耳的作用。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，槐耳可能通過調(diào)控miR-26b-5p的作用靶點EZH2起到抗腫瘤作用；EZH2可上調(diào)wnt/β-catenin信號通路，進(jìn)而上調(diào)β-catenin的表達(dá)，而β-catenin能夠上調(diào)Bcl-2的表達(dá)[7-9]。此外，槐耳多糖蛋白對非小細(xì)胞肺癌患者Th1/Th2細(xì)胞的免疫反應(yīng)狀態(tài)具有調(diào)節(jié)作用[10]。

槐耳對肺癌的治療作用研究目前主要集中在體外細(xì)胞實驗，尚無動物體內(nèi)研究進(jìn)一步證實其療效。本研究通過建立裸鼠肺癌移植瘤模型，觀察槐耳清膏對肺癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響，發(fā)現(xiàn)槐耳清膏對裸鼠移植瘤肺癌細(xì)胞具有顯著的抑瘤作用，其中5 g/kg和7 g/kg劑量下抑瘤率較高。Ki-67染色顯示，槐耳清膏組腫瘤細(xì)胞增殖活性明顯降低，提示槐耳對肺癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用。此外，與對照組相比，槐耳清膏組裸鼠體質(zhì)量逐步增長，提示槐耳對裸鼠的進(jìn)食消化吸收等胃腸道功能無明顯影響，其抑制腫瘤生長的作用可逆轉(zhuǎn)腫瘤生長引起的裸鼠體質(zhì)量減小。槐耳清膏具有不良反應(yīng)少、耐藥性低、費(fèi)用較其他治療手段少的特點，為肺癌治療的研究提供了新方向，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究[11]。

本文全體作者聲明：本研究由國家自然科學(xué)基金(81490533, 81400018, 81570028, 81770039)，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院臨床研究專項基金(2016ZSLC05)，北京醫(yī)衛(wèi)健康公益基金會醫(yī)學(xué)科學(xué)研究基金(F2037E-中山醫(yī)院)支持，不受任何其他第3方的資金贊助，本研究結(jié)果無任何相關(guān)利益沖突。