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        辣椒花藥開放式培養(yǎng)及不同基因型對(duì)花藥培養(yǎng)的影響

        2019-05-21 00:53:20楊博智周書棟董亞靜劉榮云歐立軍鄭井元馬艷青
        蔬菜 2019年5期
        關(guān)鍵詞:花藥培養(yǎng)胚狀體抑菌劑

        楊博智,周書棟,董亞靜,劉榮云,歐立軍,劉 峰,鄭井元,馬艷青*

        (1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,湖南 長(zhǎng)沙 410125; 2.湖南湘研種業(yè)有限公司,湖南 長(zhǎng)沙 410100)

        辣椒(Capsicum annuumL.)是一種重要的蔬菜作物,適應(yīng)性很強(qiáng),廣泛栽培于世界各地。近年來,我國(guó)辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,辣椒種植面積基本穩(wěn)定在150萬~200萬hm2,居蔬菜種植首位[1]。創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)資源是選育辣椒新品種的重要基礎(chǔ),而花藥培養(yǎng)是創(chuàng)新種質(zhì)資源的一種重要手段,不僅能縮短常規(guī)雜交育種所需的年限,提高選種效率,而且還能充分表現(xiàn)各種配子組合的基因型類型,在育種和基因工程研究中都具有很大的潛力。辣椒花藥培養(yǎng)研究開始較早,采用花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株的報(bào)道較多[2-6]。我國(guó)應(yīng)用花藥培養(yǎng)技術(shù)選育出的?;ㄏ盗谢ㄋ幣囵B(yǎng)辣椒品種已應(yīng)用推廣。

        對(duì)辣椒花藥進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),用于單倍體培養(yǎng)的花蕾的花萼與花瓣齊平(此時(shí)小孢子處于單核靠邊期),常規(guī)滅菌方式無法對(duì)花萼與花瓣間隙中的細(xì)菌徹底滅菌,接種后花藥染菌率仍然居高不下;特別是中國(guó)南方地區(qū),由于夏季高溫多雨,各種菌類大量滋生,雖然此時(shí)的辣椒花藥最適宜誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生,但過高的污染率導(dǎo)致了花藥培養(yǎng)效率變低。常規(guī)辣椒花藥接種方法是在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行,用尖頭鑷子挑開滅菌后的花蕾,夾取花藥接種至培養(yǎng)基中。辣椒花藥較小(花藥寬1 mm左右),鑷子夾取花藥易夾傷或夾死花藥,且該方法耗時(shí)長(zhǎng),所需人工成本高。另外,基因型特異性強(qiáng)也是限制花藥培養(yǎng)技術(shù)在辣椒遺傳改良中廣泛應(yīng)用的因素[7-9]。

        本研究通過改進(jìn)花蕾滅菌和花藥接種方式,以及往培養(yǎng)基中添加抑菌劑,簡(jiǎn)化了花藥培養(yǎng)技術(shù)流程,既能提高花藥培養(yǎng)操作效率,又有效降低了花藥染菌率;同時(shí),采用該方法比較23個(gè)辣椒品種進(jìn)行的花藥培養(yǎng)效果,篩選出高再生頻率的辣椒品種,以期為提高辣椒花藥培養(yǎng)效率,加快辣椒花藥培養(yǎng)技術(shù)的實(shí)用化奠定基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        辣椒品種為博辣紅牛、博辣5號(hào)、博辣8號(hào)、博辣紅艷、博辣瑞美、基地火辣、金線王、博辣紅星、興蔬綠劍、H15、215、博辣天星、新粗條椒、綠金線、春研13號(hào)、37-74、908、福湘錦繡、福湘佳玉、恒豐圣美、辣八螺絲王、久保田、新優(yōu)早王,均由湖南省蔬菜研究所提供。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 辣椒花藥培養(yǎng)的方法探討

        1.2.1.1 花蕾滅菌 于博辣紅?,F(xiàn)蕾期,采集花萼與花瓣齊平或花萼微露出花瓣的花蕾,放入自封口袋。置于4 ℃冰箱中低溫預(yù)處理 48 h。取出花蕾,分成2份,一份直接用于滅菌,另一份用尖頭鑷子繞離花蕾頂端約3/4處輕輕劃圈,剝?nèi)セɡ夙敳康幕ㄝ?,露出青綠色花瓣,再滅菌。滅菌方式為將花蕾置于50%的84滅菌液中滅菌10 min,再用無菌水沖洗2~3次?;ㄋ幗臃N采取用鑷子夾取的常規(guī)方法。接種14 d后統(tǒng)計(jì)花藥染菌率和死亡率,確定最佳滅菌方式。

        1.2.1.2 花藥接種 對(duì)剝?nèi)?/4花萼再用50%的84滅菌液消毒10 min的花蕾,采用2種方式接種花藥。處理組用浸泡在75%酒精中的鑷子尖微微挑開花瓣,再徒手輕輕擠壓花瓣,使花藥自然脫落于培養(yǎng)基表面;對(duì)照組采用鑷子直接夾取花藥接種至培養(yǎng)基表面。接種14 d后統(tǒng)計(jì)花藥染菌率、死亡率,確定最佳滅菌方式。

        1.2.1.3 抑菌劑種類和濃度選擇 選擇兩性霉素B和氨芐青霉素作為抑菌劑。兩性霉素B和氨芐青霉素濃度處理見表1。將博辣紅?;ㄋ幏謩e接種至添加0.5 mg/L KT、2.5 mg/L NAA、不同種類和濃度抑菌劑的NTH培養(yǎng)基中,置于恒溫培養(yǎng)箱中(35.0±0.5)℃黑暗培養(yǎng) 8 d,再轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室(25.0±0.5)℃暗培養(yǎng)至有白色胚狀體產(chǎn)生。培養(yǎng)8 d后觀察花藥染菌率和死亡率,并將未染菌的花藥重新接種至上述培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng);培養(yǎng)30 d后,觀察愈傷組織、胚狀體誘導(dǎo)情況。篩選合適的抑菌劑及其適宜濃度。

        1.2.2 花藥培養(yǎng)技術(shù)在不同辣椒品種中的應(yīng)用

        取不同基因型辣椒品種(23個(gè))花蕾,并采用優(yōu)化后的滅菌方式進(jìn)行滅菌,再將其接種至添加最佳抑菌劑濃度的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)30 d后,觀察花藥褐化及愈傷組織、胚狀體誘導(dǎo)情況。篩選出高再生頻率的辣椒品種。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        統(tǒng)計(jì)指標(biāo)及計(jì)算公式為:花藥染菌率=染菌的花藥數(shù)目/接種的花藥數(shù)目×100%;花藥褐化率=褐化的花藥數(shù)目/接種的花藥數(shù)目×100%;死亡率=死亡的花藥數(shù)目/接種的花藥數(shù)目×100%;愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的花藥數(shù)目/接種的花藥數(shù)目×100%;胚狀體誘導(dǎo)率=產(chǎn)生胚狀體的花藥數(shù)目/接種的花藥數(shù)目×100%。

        所有試驗(yàn)處理重復(fù)3次,結(jié)果取其平均值。數(shù)據(jù)采用Excel軟件做圖,SPSS16.0軟件分析顯著性差異。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 辣椒花藥培養(yǎng)方法探析

        2.1.1 兩種花蕾滅菌方式比較

        由表2可知,對(duì)剝?nèi)?/4花萼的花蕾滅菌時(shí)更易殺死花蕾表面細(xì)菌和內(nèi)生菌。接種14 d后發(fā)現(xiàn),與不剝?nèi)セㄝ嘞啾?,剝?nèi)?/4花萼處理中花藥染菌率顯著降低,降幅為66.48%;花藥褐化率和花藥死亡率增加,但差異不顯著。由此可知,采用剝?nèi)?/4花萼的花蕾進(jìn)行滅菌是合適的處理方式。

        表1 抑菌劑種類及濃度處理mg/L

        表2 花蕾滅菌處理對(duì)博辣紅牛花藥染菌率、褐化率及死亡率的影響%

        2.1.2 兩種花藥接種方式比較

        由表3可知,與鑷子夾取花藥相比,徒手?jǐn)D壓對(duì)花藥傷害小。接種14 d后觀察,徒手?jǐn)D壓花藥處理,花藥死亡率和愈傷組織誘導(dǎo)率極顯著低于鑷子夾取處理,其降幅分別達(dá)80.36%、80.04%,說明鑷子夾取花藥易夾死或夾傷花藥,導(dǎo)致花藥產(chǎn)生愈傷組織或死亡,而徒手?jǐn)D壓花藥則可降低對(duì)花藥的傷害;褐化率降低,但與鑷子夾取處理差異不顯著;花蕾接種速度為鑷子夾取處理的2.18倍,說明徒手?jǐn)D壓花藥省時(shí)、省工,可有效降低人工成本。

        2.1.3 抑菌劑種類和濃度對(duì)花藥培養(yǎng)的影響

        由表4可知,氨芐青霉素和兩性霉素B均可顯著降低花藥染菌率。2種抑菌劑合用比單獨(dú)使用一種抑菌劑效果更佳;高濃度抑菌劑雖然可以有效降低花藥染菌率,但也同時(shí)顯著提高了花藥死亡率、愈傷組織誘導(dǎo)率,抑制了胚狀體的誘導(dǎo)。往培養(yǎng)基中同時(shí)添加25 mg/L的氨芐青霉素和25 mg/L的兩性霉素B,培養(yǎng)8 d后觀察到花藥染菌率為1.42%,死亡率為3.89%;培養(yǎng)30 d后,愈傷組織誘導(dǎo)率為13.51%,胚狀體誘導(dǎo)率為3.87%,由此說明,25 mg/L的氨芐青霉素和25 mg/L的兩性霉素B適宜于辣椒花藥培養(yǎng)。

        2.2 花藥培養(yǎng)技術(shù)在不同基因型辣椒品種中的應(yīng)用效果

        由圖1可知,花藥培養(yǎng)時(shí),花藥受損易產(chǎn)生愈傷組織(圖1A),胚狀體誘導(dǎo)受抑制。觀察到的胚狀體包括子葉形胚和畸形胚(球形胚、含根毛的胚)2種類型。子葉形胚(圖1G)可直接分化成苗,而球形胚、畸形胚狀體繼續(xù)培養(yǎng)雖可以生根,但因缺乏生長(zhǎng)點(diǎn)而無法成苗(圖1B、C、D、 E、F)。

        表3 兩種接種方式對(duì)博辣紅?;ㄋ幣囵B(yǎng)及花蕾接種速度的影響

        表4 氨芐青霉素和兩性霉素B處理對(duì)博辣紅?;ㄋ幣囵B(yǎng)的影響%

        圖1 花藥培養(yǎng)胚狀體情況

        表4 不同基因型辣椒品種花藥胚狀體和單倍體植株誘導(dǎo)情況%

        由表4可知,基因型不同,花藥胚誘導(dǎo)率均存在差異。23個(gè)基因型中,子葉形胚狀體誘導(dǎo)率在0.00%~6.71%,畸形胚狀體為0.00%~2.76%。11個(gè)辣椒品種能夠同時(shí)產(chǎn)生子葉形胚狀體和畸形胚狀體,5個(gè)辣椒品種僅能產(chǎn)生畸形胚。其中博辣紅牛、H15、辣八螺絲王的花藥的子葉形胚狀體誘導(dǎo)率大于5%,滿足種質(zhì)創(chuàng)新條件。

        3 結(jié)論與討論

        目前,大多辣椒花藥培養(yǎng)文獻(xiàn)報(bào)道均采用花蕾直接滅菌,由于花萼與花瓣間隙中的細(xì)菌難以徹底殺死,接種后花藥染菌率仍然居高不下。本試驗(yàn)剝?nèi)セɡ?/4的萼片再進(jìn)行滅菌,花藥染菌率降低至5%以下,說明該方法更易殺死花蕾表面細(xì)菌和內(nèi)生菌,具有可行性。

        常規(guī)的花藥培養(yǎng)基需要高壓滅菌,接種需要在超凈工作臺(tái)中用鑷子夾取花藥轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基表面。該方法需要特定的試驗(yàn)環(huán)境,且由于辣椒花藥小,接種花藥費(fèi)時(shí)費(fèi)工,難以進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)。其他植物進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí),研究者們提出了一種新的組織培養(yǎng)方法,即通過往培養(yǎng)基中添加抑菌劑,使植物組織培養(yǎng)脫離嚴(yán)格無菌的操作環(huán)境進(jìn)行組織培養(yǎng)的一種方法,稱之為開放式組織培養(yǎng)[10-11]。目前,已廣泛應(yīng)用于葡萄、香蕉、煙草等植物的組織培養(yǎng)中[12-14]。在開放組織培養(yǎng)過程中,添加了抑菌劑的培養(yǎng)基不需要在高溫高壓下進(jìn)行滅菌,接種外植體也不需要在超潔凈的工作臺(tái)上進(jìn)行;因此,該方法從根本上簡(jiǎn)化了組織培養(yǎng)環(huán)節(jié),降低了成本。

        本研究中,選擇氨芐青霉素和兩性霉素B作為抑菌劑,用于在開放條件下博辣紅?;ㄋ幣囵B(yǎng)。結(jié)果顯示,25 mg/L的氨芐青霉素和25 mg/L的兩性霉素B適宜用于辣椒花藥培養(yǎng),花藥染菌率1.42%,死亡率為3.89%,愈傷組織誘導(dǎo)率為13.51%,胚狀體誘導(dǎo)率為3.87%,由此說明,25 mg/L的氨芐青霉素和25 mg/L的兩性霉素B適宜于用做開放式培養(yǎng)抑菌劑。此外,還改進(jìn)了花藥接種方式,試驗(yàn)結(jié)果表明:徒手?jǐn)D壓花藥可降低對(duì)花藥的傷害,花藥接種速度與傳統(tǒng)方法相比可提高2.18倍,說明徒手?jǐn)D壓花藥省時(shí)、省工,可有效降低人工成本。

        作物花藥胚狀體誘導(dǎo)率與基因型密切相關(guān)。辣椒花藥培養(yǎng)受基因型、生長(zhǎng)環(huán)境、植株?duì)顟B(tài)、培養(yǎng)基成分等多種因素的影響,基因型是影響辣椒花藥培養(yǎng)的重要因素之一[15]。本研究也表明不同基因型間花藥胚狀體誘導(dǎo)率存在差異,且從23個(gè)基因型品種中篩選到了3個(gè)高誘導(dǎo)頻率的辣椒品種,其胚狀體誘導(dǎo)率大于5%,可滿足種質(zhì)創(chuàng)新條件。

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