鄒曉萍，吳維光

流行病學(xué)調(diào)查顯示，環(huán)境污染可導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局[1]。多環(huán)芳烴類(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是常見的空氣污染物，主要來源于煤炭燃燒、汽車尾氣、煙草煙霧和室內(nèi)烹飪產(chǎn)生的油煙，且易在土壤、水源和農(nóng)作物中殘留蓄積。苯并(a)芘[(benzo(a)pyrene, BaP)]是PAHs中最具有代表性的一種環(huán)境污染物，能增加胎停育、流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)的發(fā)生率[3]。動物實(shí)驗(yàn)表明，BaP可影響胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能，進(jìn)而影響胎盤功能[4-6]，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。PAHs進(jìn)入體內(nèi)后，與細(xì)胞內(nèi)芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AhR)結(jié)合，AhR進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)后與芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(AhR nuclear translocation, ARNT)結(jié)合，啟動下游一系列靶基因轉(zhuǎn)錄和代謝酶的活化[2]。在流產(chǎn)及早產(chǎn)的胎盤絨毛中AhR呈高表達(dá)。本研究以AhR陽性表達(dá)的人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞為靶細(xì)胞，觀察BaP 體外對JEG-3細(xì)胞增殖和凋亡的作用，同時觀察AhR和 ARNT基因表達(dá)的變化，探討B(tài)aP損害滋養(yǎng)細(xì)胞的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 來源于人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的JEG-3細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫，本科實(shí)驗(yàn)室保存。BaP購自美國Sigma公司，DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司，Trizol和FITC-annexin V凋亡試劑盒購自Invitrogen公司，MTT試劑盒購自晶美公司，及轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Real-time PCR Master Mix購自日本TaKaRa 公司，鼠抗人AhR單克隆抗體和鼠抗人ARNT單克隆抗體購自美國Abcam公司，鼠抗人β-Actin單克隆抗體購自美國Genscript公司，辣根抗氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自美國KPL公司，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒和BSA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，PCR寡核苷酸引物由大連寶生物工程公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及染毒 JEG-3細(xì)胞應(yīng)用含100 mg/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、50 ml/L CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞按1×106/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁生長24 h后，培養(yǎng)液中加入二甲亞砜溶解的BaP，終濃度分別為0 μmol/L(對照組)、10 μmol/L(BaP低劑量組)、20 μmol/L(BaP中劑量組)和30 μmol/L(BaP高劑量組)。各組細(xì)胞在37 ℃、50 ml/L CO2、飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。染毒實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 MTT檢測 將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組細(xì)胞設(shè)3個平行孔。細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后，更換無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h。更換含100 mg/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、50 ml/L CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)72 h。加入20 μl濃度為5 mg/ml的四甲基偶氮唑藍(lán)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液后每孔加入150 μl的二甲基亞砜，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度值(A值)。細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均A值)/(對照組平均A值)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測 收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS液洗滌后，預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/ml。取100 μl 的細(xì)胞懸液，加到流式管中，再加入5 μl 的Annexin V，混勻后室溫下避光孵育15 min，再加入10 mg/L碘化丙錠染液5 μl。作用5 min后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡數(shù),CELL Quest軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Real-time qPCR檢測 Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測定A260/A280比值，以檢測RNA樣品的純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR分析，以磷酸甘油酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照。AhR上游引物：TGTCCTCTAAGGTGTCTGCTGCTGGA，下游引物：AACCCAACTGAGGTGGAAGTATTGA，擴(kuò)增片段長度為130 bp；ARNT上游引物：CATCCACTGACGGCTCCTACAA，下游引物：ATACACCACTCGGCCAGTCTCAC，擴(kuò)增片段長度為122 bp；GAPDH上游引物：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，下游引物：TGGTGAAGACGCCAGTGGA，擴(kuò)增片段為138 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，共40個循環(huán)，65 ℃延伸15 s。目的基因表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。

1.2.5 Western blot檢測 蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BSA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取20 μg總蛋白后進(jìn)行10%的SDS-PAGE凝膠電泳，分離后蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶封閉，洗膜后加及一抗(1∶300)，于4 ℃孵育過夜，洗膜后再加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶1000),室溫下孵育1 h。洗膜后ECL發(fā)光壓片成像。以β-actin作為內(nèi)參照，應(yīng)用Quantity One軟件，將條帶轉(zhuǎn)化為灰度值，蛋白表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞增殖率檢查結(jié)果 空白對照組、BaP低劑量組、BaP中劑量組、BaP高劑量組細(xì)胞增殖率見表1。與對照組比較，BaP低劑量組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.794)；與BaP低劑量組比較，BaP中劑量組細(xì)胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)；與BaP中劑量組比較，BaP高劑量組細(xì)胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)。

2.2 細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果 空白對照組、BaP低劑量組、BaP中劑量組、BaP高劑量組細(xì)胞凋亡率見表1。與空白對照組比較，BaP低劑量組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.293)；與BaP低劑量組比較，BaP中劑量組細(xì)胞凋亡率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)；與BaP中劑量組比較，BaP高劑量組細(xì)胞凋亡率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)。

2.3 AhR mRNA檢測結(jié)果 空白對照組、BaP低劑量組、BaP中劑量組、BaP高劑量組AhR mRNA表達(dá)量見表1。與空白對照組比較，BaP低劑量組AhR mRNA表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046)；與BaP低劑量組比較，BaP中劑量組AhR mRNA表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)；與BaP中劑量組比較，BaP高劑量組AhR mRNA表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)。

2.4 ARNT mRNA檢測結(jié)果 空白對照組、BaP低劑量組、BaP中劑量組、BaP高劑量組ARNT mRNA表達(dá)量見表1。與空白對照組比較，BaP低劑量組ARNT mRNA表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)；與BaP低劑量組比較，BaP中劑量組ARNT mRNA表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010)；與BaP中劑量組比較，BaP高劑量組ARNT mRNA表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)。

2.5 AhR蛋白檢測結(jié)果 空白對照組、BaP低劑量組、BaP中劑量組、BaP高劑量組AhR蛋白表達(dá)量見表1。與空白對照組比較，BaP低劑量組AhR蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)；與BaP低劑量組比較，BaP中劑量組AhR蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)；與BaP中劑量組比較，BaP高劑量組AhR蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)。

2.6 ARNT蛋白檢測結(jié)果 空白對照組、BaP低劑量組、BaP中劑量組、BaP高劑量組ARNT蛋白表達(dá)量見表1。與空白對照組比較，BaP低劑量組ARNT蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)；與BaP低劑量組比較，BaP中劑量組ARNT蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)；與BaP中劑量組比較，BaP高劑量組ARNT蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.020)。

表1 觀察組與對照組細(xì)胞檢測結(jié)果

表1 觀察組與對照組細(xì)胞檢測結(jié)果

檢測指標(biāo)空白對照組BaP低劑量組BaP中劑量組BaP高劑量組細(xì)胞增殖率(%)16.64±1.8217.05±1.8612.21±1.918.04±1.85細(xì)胞凋亡率(%)9.14±1.1810.20±1.1514.26±1.1616.87±1.17AhR mRNA1.41±0.131.71±0.152.10±0.172.29±0.16ARNT mRNA1.28±0.111.57±0.131.96±0.172.36±0.15AhR蛋白23.22±2.3129.54±2.3434.64±2.3539.96±2.36ARNT蛋白34.28±2.2439.94±2.3745.62±2.4151.52±2.66

3 討 論

芳香烴是含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的碳?xì)浠衔?，BaP是芳香烴化合物之一。BaP為淡黃色長針狀晶體，分子式為C20H12，為非極性物質(zhì)，不溶于水，微溶于乙醇，但具有高脂溶性，易溶于有機(jī)溶劑，如乙醚、氯仿、甲醛、苯、丙酮、環(huán)乙烷等。BaP進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)細(xì)胞色素P450混合功能氧化酶系統(tǒng)(cytochrome P450 enzymes, CYP450s )中的CPY1A1降解，可活化為BaP-7、8-環(huán)氧化物，通過氧化物水解酶，進(jìn)一步代謝為BaP-7、8-二氫-9、10環(huán)氧化物，有極強(qiáng)氧化性，可引起DNA分子的氧化損傷；還可與DNA形成加合物，影響DNA復(fù)制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和引起基因突變[7]。研究發(fā)現(xiàn)，BaP可引起鼠胎盤組織CPY450活性增高、GSH-PX活性降低、超氧化物岐化酶活性增高，引起滋養(yǎng)細(xì)胞氧化損傷，影響胎盤的形成及功能[4-6]。體外研究也發(fā)現(xiàn)BaP可引起人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞DNA的損傷[8、9]。本研究發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L和30 μmol/L的BaP體外誘導(dǎo)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。

AhR也稱二噁受體，是一種可溶性細(xì)胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)，在人體多種臟器和組織細(xì)胞，如肝、肺、腎、胎盤、扁桃體、B淋巴細(xì)胞等表達(dá)。人AhR編碼基因位于7號染色體的p15，基因包括10個內(nèi)含子和11個外顯子。AhR蛋白由805個氨基酸組成，屬于螺旋-環(huán)-螺旋超家族中新發(fā)現(xiàn)的PAS亞家族，是一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子，與多環(huán)芳烴化合物結(jié)合以前，它與兩分子的熱休克蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)及其他分子形成復(fù)合物，處于休眠狀態(tài)。當(dāng)AhR與多環(huán)芳烴化合物結(jié)合后，AhR被激活，與胞漿中蛋白復(fù)合體解離，顯露出核定位序列。AhR轉(zhuǎn)位入核后與芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(AhR nuclear translocation, ARNT)形成異二聚體轉(zhuǎn)錄因子。ARNT也屬于屬于螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子超家族中的PAS亞家族，與AhR的異二聚化作用主要發(fā)生在靠近氨基末端的堿性螺旋-環(huán)-螺旋基序和PAS區(qū)。AhR-ARET異二聚體復(fù)合物與靶基因啟動子區(qū)域二噁英效應(yīng)元件(diocin response responsive elements, XREs)結(jié)合，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄一系列基因編碼的外源代謝酶，產(chǎn)生相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)，參與組織細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞分化，細(xì)胞凋亡等。CPY1A1是AhR-ARNT復(fù)合物重要的靶基因，對環(huán)境中的毒物和化學(xué)物質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)生物節(jié)律、生殖、氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用[10-12]。AhR在人胎盤組織中的合體滋養(yǎng)細(xì)胞和胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，參與了胎盤功能的調(diào)節(jié)，在維持妊娠中發(fā)揮重要的作用[13-14]。研究證實(shí)，AhR與滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和調(diào)亡密切相關(guān)，并且具有調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞周期作用。AhR基因過表達(dá)可抑制早期滋養(yǎng)細(xì)胞增殖，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，從而影響胚胎發(fā)育及胎盤形成[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，BaP體外可直接誘導(dǎo)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞AhR及ARNT基因表達(dá)，是激活A(yù)hR轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的另一種方式。

綜上所述，BaP可抑制胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而影響胎盤形成及胎盤功能，導(dǎo)致胎停育、流產(chǎn)及早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局。激活A(yù)hR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可能是BaP損害胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的機(jī)制之一。