馮頂麗，卓麗丹，蘆 笛，李 紅，郭紅延

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)是由日本 Yamanaka 研究小組于2006 年首次成功創(chuàng)建[1]，隨后，國(guó)內(nèi)外多家實(shí)驗(yàn)室通過(guò)轉(zhuǎn)染外源特定的基因組合來(lái)誘導(dǎo)成體細(xì)胞向 iPSC的重編程。iPSC類似于胚胎干細(xì)胞，具備基因多樣性，能自我更新并分化成為多種類型的組織和體細(xì)胞。另外，iPSC的誕生克服了胚胎干細(xì)胞在臨床應(yīng)用時(shí)涉及的移植免疫排斥與倫理問(wèn)題，且成瘤率較低[2,3]。加之，與胚胎干細(xì)胞比較iPSC具有來(lái)源廣泛的巨大優(yōu)勢(shì)，任何一個(gè)成體細(xì)胞經(jīng)重編都有獲得iPSC的潛能[4]，遺傳多樣性和患者特異性細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，擴(kuò)展的細(xì)胞庫(kù)有利于新藥在目標(biāo)人群樣本中的測(cè)試，從而有助于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展[5]。另外，多能干細(xì)胞用于誘導(dǎo)產(chǎn)生人體功能性細(xì)胞和功能性類器官，構(gòu)建研究模型。如iPSC經(jīng)3D培養(yǎng)產(chǎn)生膽管細(xì)胞[6]，心肌細(xì)胞[7]，腎臟[8]，胃[9]，人體腸道器官[10]，人肺類器官[11]，神經(jīng)構(gòu)建體[12]等。這種潛能有利于對(duì)遺傳性疾病的研究與治療[13]，因此具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。iPSC具有向三胚層細(xì)胞分化的能力，本研究旨在驗(yàn)證誘導(dǎo)iPSC為中胚層的成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及外胚層神經(jīng)細(xì)胞的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料 iPSC購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)(干細(xì)胞庫(kù)編號(hào)為SCSP-1302，細(xì)胞描述為將人皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成IPS細(xì)胞，重編程轉(zhuǎn)錄因子為OCT4、SOX2、KLF4、MFC)。mTeSRTM1 培養(yǎng)液 (Stem cell, 加拿大)；Matrigel 基質(zhì)膠 (BD, 美國(guó))；DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)液、DMEM/F12、胎牛血清(FBS)、Dispase、 B-27補(bǔ)充劑(50X)、N-2補(bǔ)充劑(100X)、MEM非必需氨基酸溶液100X (Gibco)； ITS+1、抗壞血酸2-磷酸、β-甘油磷酸鈉、堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒、地塞米松、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇(Sigma，美國(guó))；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(PeproTech，美國(guó))；Y27632(APExBIO，美國(guó))；40 g/L多聚甲醛、甲苯胺藍(lán)溶液(Solarbio，北京)。倒置顯微鏡(DSZ2000X，奧特光學(xué)，重慶)。

1.2 方法

1.2.1 iPSC的培養(yǎng) 使用DMEM-F12培養(yǎng)液按30∶1 比例稀釋Matrigel 基質(zhì)膠預(yù)先處理培養(yǎng)板，約2 h, iPSC復(fù)蘇后培養(yǎng)在預(yù)先處理好的六孔板內(nèi)，培養(yǎng)液為補(bǔ)充有10 mM Y27632(ROCK1抑制劑)的mTeSR1，置于37 ℃ 5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日更換培養(yǎng)液mTeSRTM1，直到細(xì)胞生長(zhǎng)至六孔板底面積的80%～90%，進(jìn)行傳代。

將生長(zhǎng)至六孔板底面積的80%～90%的iPSC，PBS 沖洗 2 遍，用dispase酶消化并中和后，用移液管盡可能劃成均勻小塊狀后，用刮板收集iPSC 懸浮于EB形成培養(yǎng)液中 (DMEM-F12培養(yǎng)液+2 mmol/L L-谷氨酰胺+0.2 mmol/L抗壞血酸-2-磷酸), 輕輕吹打5～10次使細(xì)胞克隆變?yōu)榇笮≥^均一的小細(xì)胞團(tuán)，每 2 d 更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)7 d。

將培養(yǎng)瓶中的EB球，用DMEM-F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)沖洗 2 遍后，更換MSCs 誘導(dǎo)培養(yǎng)液(DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10% FBS+2 mmol/L L-谷氨酰胺+0.1 mmol/L 2-巰基乙醇+非必需氨基酸)，將培養(yǎng)液和細(xì)胞的混合液吸至Matrigel 基質(zhì)膠鋪板的6孔板內(nèi)，讓其貼壁并增殖4～7 d，進(jìn)行下一步操作，后續(xù)所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

0.25%胰酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種至6孔板內(nèi)，并繼續(xù)使用 MSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%后，0.25%胰酶消化細(xì)胞并按照1∶3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞可用來(lái)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)表面標(biāo)志物的鑒定及成骨、成軟骨的鑒定。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志 胰酶消化iPS-MSCs 后重懸細(xì)胞分為5管，每管加入濃度為 2×105/100 μl細(xì)胞懸液后，300 g 離心7 min 后去上清，分別加入熒光標(biāo)記小鼠抗人單克隆抗體CD29 CD105 CD34 CD45，對(duì)照管不做處理；室溫下避光反應(yīng)15 min，加入1 ml PBS混勻，以300 g離心7 min，洗滌3次。200 μl PBS液重懸，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 成骨誘導(dǎo)分化及檢測(cè) 將誘導(dǎo)的MSCs 樣細(xì)胞以8×104個(gè)/cm2的密度接種于6孔板，第 2天換成骨誘導(dǎo)液(α-MEM、15% 胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L維生素 C、10 mmoL/L β-甘油磷酸鈉)，每 3 d換液 1次。誘導(dǎo)期間每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。成骨誘導(dǎo)14 d后按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase)活性檢測(cè)，倒置顯微鏡觀察染色細(xì)胞并拍照。

1.2.4 成軟骨誘導(dǎo) 將3×105個(gè)iPS-MSCs細(xì)胞置于15 ml聚丙烯管中，以1200 r/min離心3 min，并重新懸浮于軟骨形成培養(yǎng)液(高糖DMEM，10%FBS，1%ITS+1，1mM丙酮酸鈉，50 μg/ml抗壞血酸2-磷酸，50 μg/ml脯氨酸，人10 ng / ml TGF-β1，100 nM地塞米松)，旋松離心管蓋，正立于37 ℃、5% CO2、濕度大于 95% 的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h 后，加入成軟骨誘導(dǎo)體系 0.5 ml。每 3 d換液，誘導(dǎo)4周后，將細(xì)胞微球以 10%中性甲醛固定，送病理科進(jìn)行石蠟包埋切片。切片用5% 甲苯胺藍(lán)37 ℃染色 30 min，水洗、封片、拍照。

1.2.5 成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo) 將EB 鋪板，培養(yǎng)4 d的細(xì)胞以8×104個(gè)/cm2的密度接種于 6孔板，第 2天換成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)液[DMEM / F-12培養(yǎng)液，神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1%FBS，1×谷氨酰胺，1× N2添加劑，和1×B27添加劑]，BDNF/GDNF 10 μg/ml誘導(dǎo)期間每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2 結(jié) 果

2.1 iPSC及誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)的變化 iPSC在Matrigel 基質(zhì)膠上呈典型的克隆狀生長(zhǎng)，克隆呈集落狀、隆起的圓形或者橢圓形，邊界清晰，細(xì)胞團(tuán)內(nèi)細(xì)胞排列緊密，界限和形態(tài)不易區(qū)分(圖 1A)；將細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)形成EB過(guò)程中，細(xì)胞團(tuán)逐漸變大且變得致密，顯微鏡下為大小較為均勻的小球(圖 1B)；將EB球接種在6孔板后，細(xì)胞球在板內(nèi)鋪展生長(zhǎng)，增殖速度加快，細(xì)胞之間排列更加致密，細(xì)胞呈現(xiàn)層疊生長(zhǎng)(圖 1C)；單個(gè)細(xì)胞接板進(jìn)行培養(yǎng)后，可見(jiàn)細(xì)胞體積逐漸增大，逐漸向集落周圍伸展，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增多，向外伸展的細(xì)胞逐漸增多，并呈圓形或橢圓形平鋪于培養(yǎng)板底，細(xì)胞排列緊密，胞質(zhì)豐富(圖1D)。

圖1 iPSC向MSCs細(xì)胞分化過(guò)程中不同階段細(xì)胞形態(tài)

2.2 細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，iPSC中 CD105、CD29表達(dá)陽(yáng)性， CD34、CD45表達(dá)陰性，符合iPSC--- MSCs表面標(biāo)志物表達(dá)結(jié)果(圖2)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定 iPS-MSCs 細(xì)胞表面標(biāo)志物

2.3 iPSC-MSCs分化能力的鑒定 (1)成骨誘導(dǎo): iPSC-MSCs成骨誘導(dǎo)14 d倒置顯微鏡下可見(jiàn)較多細(xì)胞由梭形變?yōu)槎嘟切魏蜋E圓形，且胞體增大，突起增多，胞核變大變圓，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較多顆粒。堿性磷酸酶染色示細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色沉淀(圖 3A)。(2)成軟骨誘導(dǎo): iPSC-MSCs 經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)4周后可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)聚集成小球狀， 切片經(jīng) 1% 甲苯胺藍(lán)染色后可見(jiàn)軟骨基質(zhì)呈藍(lán)色(圖3B)。(3)成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo):經(jīng)貼壁培養(yǎng)可觀察到神經(jīng)纖維狀突起呈放射狀從克隆團(tuán)周圍伸出。維持培養(yǎng)，形態(tài)學(xué)改變的細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞分叉增多，呈現(xiàn)神經(jīng)元樣形態(tài)(圖3C)。

圖3 iPSC-MSCs 多向分化能力的鑒定

3 討 論

iPSC 技術(shù)的誕生極大豐富了干細(xì)胞的來(lái)源[14，15]。近年來(lái)，iPSC技術(shù)發(fā)展迅速，早期如致瘤率高、誘導(dǎo)效率低、iPSC全能性差等問(wèn)題都逐漸得到解決。目前，雖然iPSC還不能完全代替胚胎干細(xì)胞，但是其成功地避免了免疫排斥和倫理問(wèn)題，因此成為再生醫(yī)學(xué)理想的種子細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的人iPSC具有和胚胎干細(xì)胞類似的生長(zhǎng)特性，能在體外長(zhǎng)期穩(wěn)定地傳代培養(yǎng)并保持未分化狀態(tài)。將iPSC培養(yǎng)形成EB球后，經(jīng)特定培養(yǎng)液誘導(dǎo)后外胚層細(xì)胞可分化為神經(jīng)細(xì)胞，中胚層細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)可表現(xiàn)出MSCs 的生長(zhǎng)特性和分化特性，中、外胚層的多向分化特性綜合證明了該實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)及誘導(dǎo)方法的有效性和可借鑒性。

在iPSC的培養(yǎng)階段，諸多研究者會(huì)用滋養(yǎng)層對(duì)iPSC進(jìn)行培養(yǎng)[16-18]，但因考慮到飼養(yǎng)層細(xì)胞的好壞可以影響iPSC細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及進(jìn)行飼養(yǎng)層培養(yǎng)的復(fù)雜性，本實(shí)驗(yàn)以Matrigel 基質(zhì)膠代替飼養(yǎng)層組織，結(jié)合 mTeSRTM 1 培養(yǎng)液培養(yǎng)iPSC，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程。

iPSC培養(yǎng)形成EB球后，因神經(jīng)細(xì)胞是由外胚層細(xì)胞分化而來(lái)，本實(shí)驗(yàn)將形成的EB球直接用于成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)而不經(jīng)過(guò)MSCs階段，區(qū)別于后續(xù)成骨、成軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)。

從EB球到誘導(dǎo)形成MSCs 樣細(xì)胞, 并經(jīng)多次傳代純化MSCs細(xì)胞。從形態(tài)學(xué)上發(fā)現(xiàn)MSCs 樣細(xì)胞逐漸展現(xiàn)出長(zhǎng)梭形。表面標(biāo)記已成為鑒定MSCs群體的標(biāo)準(zhǔn)工具，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定iPSC-MSCs 表面標(biāo)志物表達(dá)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)iPSC-MSCs中 MSCs標(biāo)記物內(nèi)皮糖蛋白CD105，整合素家庭成員CD29 均表達(dá)陽(yáng)性,表達(dá)量分別為 99.56%和99.47%，造血干細(xì)胞標(biāo)志物 CD34 和泛白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45 均表達(dá)陰性(3.77% 和3.70%)，與MSCs 表面標(biāo)記物的表達(dá)結(jié)果相符。說(shuō)明通過(guò)該方法可以成功將 iPSC 誘導(dǎo)為MSCs樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后 iPSC -MSCs 經(jīng)多次傳代后均能保持一致，且經(jīng)分化誘導(dǎo)后，成骨、成軟骨染色都為陽(yáng)性結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)中iPSC -MSCs的誘導(dǎo)是采取經(jīng)典策略---逐步分化，即先將iPSC 在體外形成擬胚體，隨后通過(guò)更換擬胚體細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，再進(jìn)一步使用MSCs培養(yǎng)液誘導(dǎo)其分化為MSCs樣細(xì)胞，最后通過(guò)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液將MSCs樣細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化[11-13]。該方法獲得的MSCs樣細(xì)胞純度高，但需經(jīng)過(guò)多次傳代分選，操作相對(duì)繁瑣。有研究者在此基礎(chǔ)上做了簡(jiǎn)化，iPSC不先形成EB球，而是通過(guò)將iPSC一步分化為MSCs后誘導(dǎo)為譜系細(xì)胞[14，15]。

本研究采用較為簡(jiǎn)便的方法成功驗(yàn)證iPSC的多向分化能力，為進(jìn)一步研究和應(yīng)用iPSC 奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。隨著研究的深入，iPSC可能成為再生治療組織損傷的一種新的細(xì)胞來(lái)源。但是，iPSC的研究仍處于初級(jí)階段，今后需要更深入研究iPSC定向分化的具體機(jī)制、調(diào)控要點(diǎn)、影響因素等，明確功能恢復(fù)機(jī)制、優(yōu)化細(xì)胞移植條件，使得iPSC真正成為再生醫(yī)學(xué)中的理想工具。