李志彬 郭玉海 邢慶嘉 劉權(quán)鋒

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東省廣州市 510000，電子郵箱：1529025610@qq.com)

脊髓損傷是脊柱損傷最嚴(yán)重的并發(fā)癥，?？蓪?dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下肢體嚴(yán)重的功能障礙，這不僅給患者的身體和心理造成嚴(yán)重傷害，還給整個(gè)社會增加巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。脊髓損傷的預(yù)防、治療和康復(fù)已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的研究重點(diǎn)之一。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)是一種普遍存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，具有向脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等分化潛能[1-4]。此外，BMSC可在體外存活并且迅速增殖[5]，最重要的是其具有免疫原性低、免疫耐性強(qiáng)，可異體移植等優(yōu)點(diǎn)[6]。BMSC向神經(jīng)元細(xì)胞分化是目前的研究熱點(diǎn)之一[7]。曾有學(xué)者將BMSC移植到脊髓損傷的動物體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)BMSC能夠向神經(jīng)元細(xì)胞分化，雖然實(shí)驗(yàn)動物的脊髓功能在一定程度上可以恢復(fù)，但療效并不滿意[8]。因此，本研究在Wnt信號通路下，利用中藥微球誘導(dǎo)BMSC向神經(jīng)元細(xì)胞分化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 (1)標(biāo)本及試劑：成人骨髓來源于5名成年自愿者的無器質(zhì)性病變的肋骨。胎牛血清購自美國HyClone公司(批號：SH30087.01)，無血清改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)-高糖培養(yǎng)基、青/鏈霉素、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)均購自美國HyClone公司(批號：SH30022.01B、SH30010、SH30256.01B)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司(批號：RR047A、HRR820A)。Anti-CD11a抗體[異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocynate,FITC)]、Anti-CD14抗體[藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)/Cy5.5?]、Anti-CD29抗體均購自Abcam公司(批號：ab27387、ab25390、ab78502)。Wnt3a、Wnt5a均購自R&D公司(批號：5036-WN、645-WN)。一抗包括抗神經(jīng)絲蛋白-M(neurofilament-M，NF-M)抗體、抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)抗體、抗巢蛋白抗體、抗微管聯(lián)合蛋白(microtubule-associated protein,MAP)-2抗體、抗生長相關(guān)蛋白(growth-associated protein,GAP)-43抗體(EP890Y)、抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體均購自Abcam公司(批號：ab24574、ab53025、ab6320、ab5392、ab75810、ab7260)；二抗包括兔抗人IgG H&L(辣根過氧化物酶)和山羊抗人IgG H&L(辣根過氧化物酶) 均購自Abcam公司(批號：ab6759、ab6858)。(2)設(shè)備：MSH-R-20型磁力攪拌器購自KEWLAB公司，SW-CJ-IF(D)型潔凈工作臺購自蘇州安泰科技有限公司，TDL-80-2B型低速離心機(jī)購自蘇州安泰科技有限公司，BDS200型倒置光學(xué)顯微鏡購自蘇州安泰科技有限公司,HERAcell 150i型細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾科技公司，K2800微量分光光度計(jì)購自北京凱奧公司，Accuri C6流式細(xì)胞儀購自BD公司。(3)藥品：中藥微球與空白微球供試品由廣東藥學(xué)院研制(批號：20140317b)。海藻鹽購自美國FMC公司(批號：131004)，10%參麥液購自正大青春寶藥藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字:Z33020021)，殼聚糖購自齊云生物科技有限公司(批號：2011107)，成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)購自R&D公司(批號：233-FB)。

1.2 BMSC的分離培養(yǎng)及其鑒定

1.2.1 分離培養(yǎng)：無菌條件下，用50 mL含0.01%肝素的PBS稀釋骨髓液，充分混勻后轉(zhuǎn)入離心管，1 500 r/min、20℃離心20 min，棄上清及脂肪層，用DMEM充分混勻后沉淀；取20 mL稀釋液輕輕疊加到20 mL Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(密度為1.077×103g/L)上，2 000 r/min、20℃離心30 min，收集單核細(xì)胞層；用無血清DMEM洗滌兩次，分別1 500 r/min離心10 min后按1×105個(gè)細(xì)胞/cm2接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于0.5% CO2的培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)；3 d后半量更換培養(yǎng)液，2～3 d等量換液1次。

1.2.2 傳代培養(yǎng)：分離培養(yǎng)10 d貼壁細(xì)胞接近融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。無菌操作下打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶蓋，棄舊培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1～2次，加入1 mL胰酶細(xì)胞消化液溶液，輕洗細(xì)胞皿底部。吸掉消化液，放入37℃培養(yǎng)箱2～3 min，輕拍培養(yǎng)瓶壁使大部分細(xì)胞脫落，于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，加入適量含血清的新鮮DMEM以終止胰蛋白酶的作用，吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混勻后，補(bǔ)足3n mL(n為傳代瓶數(shù))DMEM，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，于5% CO2、飽和濕度、37℃下培養(yǎng)。

1.2.3 鑒定：取第3代培養(yǎng)細(xì)胞，分成3管，每管細(xì)胞濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/100 μL，其中A管作為空白對照，B管用于CD29-PE和CD11a-FITC檢測，C管用于CD14-FITC和CD29-PE雙標(biāo)記檢測。A管中不加抗體，加100 μL固定液，于室溫避光孵育20 min；B管和C管分別加入相應(yīng)抗體各5 μL后，室溫避光孵育20 min。各管加入500 μL PBS洗滌1次，1 200 r/min離心5 min，棄上清，加0.2 mL PBS重懸細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞儀分別檢測CD14-FITC、CD11a-FITC和CD29-PE的熒光強(qiáng)度，以分析CD11a、CD14和CD29的表達(dá)情況。

1.3 中藥微球定向誘導(dǎo)后的神經(jīng)元樣細(xì)胞鑒定

1.3.1 微球的制作：(1)中藥微球：把含有3%(v/v)司盤-80的液體石蠟用磁力攪拌器以900 r/min攪拌10 min后，添加3%海藻酸鈉液2 mL及10%參麥液1 mL的混合液，繼續(xù)以900 r/min攪拌10 min，隨后加入2 mL 3%殼聚糖(溶解于去離子水中)以900 r/min攪拌10 min，再緩慢加入3 mL的3%氯化鈣(溶解于去離子水中)以確保高效交聯(lián)。分別使用松節(jié)油、95%酒精和蒸餾水以6 000 r/min各自離心15 min。提取微球，室溫下風(fēng)干。(2)空白微球：同樣將含有3%(v/v)司盤-80的液體石蠟以900 r/min攪拌10 min后，單純添加3%海藻酸鈉2 mL繼續(xù)以900 r/min攪拌10 min，余步驟與中藥微球相同。

1.3.2 中藥微球誘導(dǎo)BMSC：將無菌的中藥微球與空白微球分別用低糖DMEM完全培養(yǎng)基浸泡3 d。選取第3代的BMSC分為空白組和誘導(dǎo)組。兩組BMSC均以2×105個(gè)細(xì)胞/mL接種到預(yù)先置有蓋玻片的6孔板中制備細(xì)胞爬片，待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，棄培養(yǎng)基，加入含10 μg/L bFGF的DMEM完全培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)24 h，PBS洗滌3次，空白組加入含空白微球的無血清DMEM培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含中藥微球的無血清DMEM培養(yǎng)基，空白微球和中藥微球在培養(yǎng)基的終濃度均為1 mg/100 mL。兩組均誘導(dǎo)3 h，每隔15 min于倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法鑒定神經(jīng)元樣細(xì)胞：誘導(dǎo)3 h后，采用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-生物素化過氧化物酶復(fù)合物法檢測空白組和誘導(dǎo)組NF-M、NSE、巢蛋白、MAP-2、GAP-43、GFAP的表達(dá)。PBS漂洗誘導(dǎo)后的細(xì)胞2次(2 min/次)后，4%多聚甲醛室溫下固定20 min；0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Sigma公司，T9284)室溫下處理20 min；3% H2O2室溫下處理15 min。以上每一步驟結(jié)束時(shí)均采用PBS漂洗3次(2 min/次)。加入試劑盒中的血清封閉液，37℃孵育20 min后甩干封閉液，加入相應(yīng)的一抗(1 ∶200；陰性對照用PBS代替一抗)，37℃孵育1～2 h或4℃過夜；PBS漂洗，2 min/次，共3次，加入試劑盒中的二抗，37℃孵育20 min；PBS漂洗，2 min/次，共3次，放入SABC濕盒內(nèi)37℃孵育20 min；PBS漂洗，4 min/次，共3次，DAB顯色2～10 min，自來水沖洗；蘇木素復(fù)染15～30 s，自來水沖洗，封片劑封片，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用Image-Pro Plus 6.0軟件(美國Media Cybernetics公司)計(jì)算各蛋白的平均吸光度(A值)；對于NSE和MAP-2的蛋白含量表達(dá)，計(jì)算陽性率，陽性率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，陽性細(xì)胞通過Image-Pro Plus 6.0軟件用肉眼觀察進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞胞體及部分突出DAB染色為棕黃色即為陽性細(xì)胞。

1.4 Wnt3a和Wnt5a誘導(dǎo)后巢蛋白、NSE和GFAP mRNA的表達(dá)情況 將第3代BMSC細(xì)胞以2×105個(gè)/mL接種于6孔板中，設(shè)Wnt3a、Wnt5a組及對照組。Wnt3a組和Wnt5a組分別采用誘導(dǎo)液1(DMEM、100 μg/mL bFGF、50 μg/L Wnt3a、參麥液微球)和誘導(dǎo)液2(DMEM、100 μg/mL bFGF、50 μg/L Wnt5a、參麥液微球)進(jìn)行誘導(dǎo)，對照組不加Wnt分子而單純采用誘導(dǎo)劑(DMEM、100 μg/mL bFGF、參麥液微球)培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)2周后收集細(xì)胞，采用PCR檢測巢蛋白、NSE和GFAP mRNA的表達(dá)情況。PCR步驟：(1)總RNA的提?。菏褂肨RIzol試劑盒提取已成功誘導(dǎo)的BMSC的總RNA,在微量分光光度計(jì)測定RNA的濃度及質(zhì)量。(2)cDNA的合成:取2 μg總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒,采用兩步法獲取cDNA備用，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。(3)PCR反應(yīng)：參考PCR試劑盒說明書方法進(jìn)行操作,以同一cDNA為模板,在20 μL反應(yīng)體系內(nèi)擴(kuò)增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，引物序列見表1。反應(yīng)體系：cDNA(稀釋3倍)5.0 μL；上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL；SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL；dH2O 4.0 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 3 s，60℃ 34 s，循環(huán)45次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。最后使用ViiA7軟件分析數(shù)據(jù)，以2-△△Ct計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSC的分離培養(yǎng)及鑒定 光鏡下可見第3代BMSC呈長梭或長的多角形，有較多的突出，見圖1。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，CD11a和CD14標(biāo)記物均為陰性(陽性率分別為0.465%、0)，CD29標(biāo)記物為陽性(陽性率為98.7%)，分離培養(yǎng)的BMSC純度達(dá)到98%以上，可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 光鏡下分離培養(yǎng)的BMSC(×250)

2.2 微球定向誘導(dǎo)分化神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定結(jié)果 誘導(dǎo)組NF-M、巢蛋白、GAP-43的平均A值以及NSE、MAP-2陽性率均高于空白組(均P<0.05)，而兩組的GFAP平均A值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3 Wnt3a和Wnt5a誘導(dǎo)后巢蛋白、NSE和GFAP mRNA的表達(dá)情況 3組細(xì)胞巢蛋白mRNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Wnt3a組的NSE和GFAP mRNA相對表達(dá)水平均高于其他兩組(均P<0.05)，而Wnt5a組與對照組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表2 兩組細(xì)胞免疫組化檢測指標(biāo)比較(x±s)

表3 3組細(xì)胞巢蛋白、NSE和GFAP mRNA的相對表達(dá)水平比較(x±s)

注：與對照組相比，*P<0.05；與Wnt5a組相比，#P<0.05。

3 討 論

BMSC是一種多分化型干細(xì)胞。2000年Woodbury首次報(bào)告可以將BMSC誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元細(xì)胞等[1]，此后相關(guān)實(shí)驗(yàn)室都在開展如何將BMSC向神經(jīng)元細(xì)胞方向誘導(dǎo)的研究。在目前大部分實(shí)驗(yàn)中，各研究者都是以BMSC貼壁培養(yǎng)作為主要的研究方向[9]，但是隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，BMSC向神經(jīng)元細(xì)胞分化的能力有所下降，細(xì)胞凋亡率高。

參麥注射液主要是由人參和麥冬等量組成，起源于《癥因脈治》的參麥飲。現(xiàn)普遍認(rèn)為參麥注射液具有益氣養(yǎng)陰、生津止渴、斂陰固脫的功效，而國內(nèi)多項(xiàng)研究均表明，益氣養(yǎng)陰溫陽中藥具有抑制細(xì)胞凋亡，改善能量代謝的功能[10-11]，因此推測其可以有效改善BMSC體外凋亡率高的問題。因此我們以參麥液提取物制作中藥緩釋微球，其平均粒度為4.226 μm，粒徑呈正態(tài)分布，載藥穩(wěn)定，平均載藥量為2.12%，含量相對穩(wěn)定、釋放度基本不變，可有效控制藥物釋藥濃度。

CD29是介導(dǎo)干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附的最主要分子，被認(rèn)為是BMSC的重要標(biāo)志物[12]，而CD11a、CD14為造血干細(xì)胞特異標(biāo)記[13]。本研究將BMSC進(jìn)行分離與傳代培養(yǎng)，所分離培養(yǎng)的細(xì)胞廣泛表達(dá)CD29，不表達(dá)CD11a和CD14，說明本實(shí)驗(yàn)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞不屬于造血系細(xì)胞，而是BMSC。我們選用第3代BMSC，用含空白微球及中藥微球的無血清培養(yǎng)基分別進(jìn)行誘導(dǎo)，然后檢測NF-M、NSE、巢蛋白、MAP-2、GAP-43、GFAP的表達(dá)。其中巢蛋白是神經(jīng)干細(xì)胞的特殊標(biāo)記，NSE是神經(jīng)細(xì)胞的特定標(biāo)記，而GFAP是膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記,NF-M是構(gòu)成神經(jīng)細(xì)胞軸突中間絲的蛋白質(zhì),GAP-43是一種與細(xì)胞及組織整體發(fā)育有關(guān)的蛋白之一,廣泛存在于神經(jīng)元細(xì)胞。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組NF-M、巢蛋白、GAP-43的平均A值以及NSE、MAP-2陽性率均高于空白組(均P<0.05)，提示參麥微球復(fù)合BMSC后可以誘導(dǎo)BMSC向神經(jīng)元細(xì)胞分化。

Wnt基因是由果蠅無翅基因Wingless和小鼠乳腺癌中的Int-1基因合并起來命名的，其特征為含有22～24 個(gè)保守型半胱氨酸殘基，現(xiàn)已在人類基因組中發(fā)現(xiàn)有19種Wnt基因，Wnt通路分為經(jīng)典和非經(jīng)典兩種，其中Wnt3a參與經(jīng)典途徑[14]。經(jīng)典的Wnt途徑又稱 Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路，由Wnt蛋白、跨膜受體、胞質(zhì)蛋白、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子、下游靶基因等組成[15]。在Wnt信號下，Wnt激活其跨膜受體，并激活胞漿中的散亂蛋白，活化的散亂蛋白成為糖原合成激酶復(fù)合物的抑制物，阻止其對β-連環(huán)蛋白的降解，游離的β-連環(huán)蛋白在胞漿中積聚，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子—淋巴增強(qiáng)因子/T 細(xì)胞因子協(xié)同作用，激活下游靶基因的表達(dá)。故本研究在Wnt基因信號下應(yīng)用益氣養(yǎng)陰中藥微球誘導(dǎo)BMSC，然后檢測巢蛋白、NSE和GFAP mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，Wnt3a組的NSE和GFAP mRNA相對表達(dá)水平均高于其他兩組(均P<0.05)，而Wnt5a組的NSE和GFAP mRNA相對表達(dá)水平與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。這提示W(wǎng)nt3a對BMSC細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化有明顯的誘導(dǎo)作用，而Wnt5a并沒有此作用。

綜上所述，利用中藥參麥微球與BMSC相結(jié)合，可成功誘導(dǎo)BMSC向神經(jīng)元細(xì)胞方向分化，Wnt3a信號通路對其有促進(jìn)作用。但在人體內(nèi)BMSC能否被誘導(dǎo)分化或自然分化為神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，則有待于進(jìn)一步研究。