柴小敏，孫 娜，晏永新，孫耀貴，李宏全

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801 ； 2.山西優(yōu)勢(shì)肉用家畜高效安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，山西太谷030801)

雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis，IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。IB的頻繁發(fā)生，加之可運(yùn)用在臨床防治IB的藥物甚少，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前防治IB主要措施仍是接種疫苗，但由于IBV血清型多，變異快，疫苗難以交叉保護(hù)，使用不當(dāng)還會(huì)導(dǎo)致IBV基因重組，從而不斷產(chǎn)生新的基因型，故依靠疫苗來(lái)防治IB效果不甚理想[2]。因此，研制新型抗病毒的藥物成了必然趨向。

大量研究證實(shí)，多種中藥成分有抗病毒、抑菌和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期篩選了多種具有抗病毒作用的天然化合物，確定甘草酸二鉀、苦參堿、丹參酮ⅡA磺酸納、茶皂素、綠原酸和黃芩苷具有抗PRRSV的作用[3-4]；苦參堿、黃芩苷對(duì)PCV2有抗病毒活性[5]；甘草酸二鉀、丹參酮ⅡA磺酸納對(duì)MDV的抑制作用顯著[6]。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)根據(jù)組方原理，并結(jié)合現(xiàn)代中藥生產(chǎn)技術(shù)，研制出由板藍(lán)根、連翹、石膏、地黃、郁金和知母等組成的抗病毒顆粒，方中板藍(lán)根為君藥，清熱解毒，具有良好的抗病毒功效[7]，連翹抗菌、抗病毒[8]，石膏解肌熱、清肺火[9]，地黃滋陰涼血，郁金活血止痛、行氣解郁，知母清熱瀉火、止咳除煩[9]，諸藥合用具有涼血解毒、清熱祛濕和止咳平喘的功效。本試驗(yàn)旨在評(píng)價(jià)抗病毒顆粒對(duì)IB的藥效，并對(duì)其抗病毒機(jī)制進(jìn)行初探，以確定用藥劑量及后續(xù)機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 病毒及試驗(yàn)動(dòng)物 雞傳染性支氣管炎病毒(M41株)，批號(hào)：AV1511，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。360只1日齡伊莎褐健康雞，購(gòu)自山西康牧有限公司。

1.2 試驗(yàn)藥物 抗病毒顆粒，試生產(chǎn)于亳州市乾元?jiǎng)游锼帢I(yè)有限責(zé)任公司。規(guī)格：每1 g相當(dāng)于原生藥1.2 g；100 g/袋。生產(chǎn)批號(hào)：20160801。麻杏石甘散，江西省特邦動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)：獸字號(hào)(2012)140345174，生產(chǎn)批號(hào)：20170507，規(guī)格為 500 g/袋。

1.3 主要試劑 TRIzol總RNA提取試劑盒，購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自Biotool公司；膠回收試劑盒(E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit)、質(zhì)粒提取試劑盒(E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit)，均購(gòu)自美國(guó)Omega公司；T5 Zero載體(pEASY?-T5 Zero Cloning kit)，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix(Low ROX)，購(gòu)自Biotool公司；2×TaqPCR Master Mix和DNA Marker，均購(gòu)自北京中科瑞泰生物科技有限公司。

1.4 IBV種毒復(fù)壯與雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測(cè)定 將IBV種毒凍干粉用生理鹽水1∶10稀釋?zhuān)尤?0 μL青霉素和鏈霉素混合液，4 ℃作用6 h，按0.2 mL/胚的劑量經(jīng)尿囊腔接種于SPF雞胚(9日齡)，37 ℃培養(yǎng)48 h后，無(wú)菌收集雞胚尿囊液，1 000 r/min離心20 min。吸取上清液，置于-20 ℃保存。試驗(yàn)用的毒種是IBV盲傳第3代病毒，其EID50經(jīng)測(cè)定為10-4.27/0.2 mL。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取360只8日齡雛雞，隨機(jī)分為6組，分別為A組(抗病毒顆粒高劑量組)、B組(抗病毒顆粒中劑量組)、C組(抗病毒顆粒低劑量組)、D組(陽(yáng)性藥物對(duì)照組)、E組(空白對(duì)照組)、F組(病毒對(duì)照組)，每組60只，將每組分為a、b兩個(gè)小組，每小組30只。其中a組雛雞用于臨床療效觀察和平均增重測(cè)定，b組雛雞用于感染IBV后不同時(shí)間點(diǎn)免疫器官指數(shù)、靶器官病毒拷貝數(shù)及氣管中IFN-β表達(dá)量的測(cè)定及病理組織學(xué)觀察。分組見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6 各藥物組臨床療效觀察及指標(biāo)測(cè)定 試驗(yàn)期間，觀察a組雛雞的精神、飲食、行為等情況。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，統(tǒng)計(jì)各雛雞的痊愈數(shù)、有效數(shù)和死亡數(shù)，計(jì)算痊愈率、有效率、死亡率、總有效率，綜合評(píng)價(jià)抗病毒顆粒的臨床療效。

1.7 各試驗(yàn)組雛雞平均增重 試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)，取a組中每個(gè)重復(fù)的所有雛雞，以重復(fù)為單位稱(chēng)重，計(jì)算各試驗(yàn)組的平均體重、平均增重和平均增重率。

1.8 各試驗(yàn)組雛雞免疫器官指數(shù) 分別于雛雞感染IBV第6、9、12天和15天時(shí)，從各試驗(yàn)組的b組中隨機(jī)取6只雛雞，每個(gè)重復(fù)2只，稱(chēng)取體重，剖檢取其胸腺、脾臟、法氏囊稱(chēng)重，計(jì)算臟器指數(shù)。免疫器官指數(shù)=免疫器官重量(mg)/體重(g)。

1.9 各試驗(yàn)組雛雞組織病理學(xué)觀察 分別于雛雞感染IBV第6、9、12天和15天時(shí)，從各試驗(yàn)組的b組中隨機(jī)取6只雛雞，每個(gè)重復(fù)2只，剖檢，觀察病理變化，取氣管、肺部分組織在Bouin氏固定液中固定，分別進(jìn)行脫水、透明和石蠟包埋，做5 μm厚切片，H.E.染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.10 各試驗(yàn)組雛雞氣管、支氣管、肺臟中IBVN基因的拷貝數(shù) 分別于雛雞感染IBV第6、9、12天和15天時(shí)，取各組雛雞氣管、支氣管、肺臟凍存，參照Invitrogen TRIzol提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)所提RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用NCBI網(wǎng)站引物設(shè)計(jì)工具，根據(jù)IBVN基因保守序列設(shè)計(jì)引物，并制備重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，以10倍倍比稀釋的重組質(zhì)粒為模板，加入IBVN基因上下游引物，進(jìn)行SYBR Green RT-PCR擴(kuò)增，以各稀釋度的起始模板量和其對(duì)應(yīng)的Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，按照qPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件檢測(cè)各組織中所含IBVN基因的拷貝數(shù)。

1.11 各試驗(yàn)組雛雞氣管中IFN-β的表達(dá)量 選取感染IBV第9天雛雞各組氣管凍存，參照Invitrogen TRIzol提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)所提RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用NCBI網(wǎng)站引物設(shè)計(jì)工具，根據(jù)β-actin基因、IFN-β基因保守序列設(shè)計(jì)引物，采用Comparative ΔΔCt法，對(duì)各樣本IFN-β mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析，計(jì)算RQ值(2-ΔΔCt)。

表2 引物序列及產(chǎn)物大小

1.12 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用EXCEL2010版和GraphPad PrismTM5軟件(GraphPad Software，Inc.California，USA)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析。采用One-way Anova來(lái)確定各組之間的差異性，所有數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示。字母相同者，表示差異不顯著(P>0.05)；字母不同者，表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 雛雞感染IBV后臨床癥狀觀察 采用104.27EID50IBV第3代雞胚尿囊液，以0.2 mL/只的劑量滴鼻點(diǎn)眼感染雛雞，感染48 h后，與E組相比，其他各試驗(yàn)組雛雞均出現(xiàn)了IB典型臨床癥狀，主要表現(xiàn)為扎堆、精神沉郁、食欲下降、咳嗽等癥狀。攻毒72 h后開(kāi)始用藥，通過(guò)用藥后不同時(shí)間段的觀察，發(fā)現(xiàn)各藥物治療組病雞精神狀態(tài)開(kāi)始好轉(zhuǎn)，食欲與E組無(wú)明顯差異，咳嗽雛雞數(shù)量明顯減少，尤以A、B組癥狀減輕最為顯著，D組次之，試驗(yàn)中后期A、B組雛雞臨床癥狀基本消失。結(jié)果表明，抗病毒顆粒對(duì)IB療效確切。

2.2 各試驗(yàn)組臨床療效測(cè)定 與F組相比，各藥物組總有效率、痊愈率均顯著增高(P<0.05)，死亡率均顯著降低(P<0.05)。與D組相比，A、B組總有效率均有增高趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)，痊愈率均顯著增高(P<0.05)，C組總有效率、痊愈率均顯著降低(P<0.05)，A、B組死亡率均顯著降低(P<0.05)，C組死亡率顯著增高(P<0.05)(見(jiàn)表3)。結(jié)果表明：A、B組對(duì)人工感染IB均有良好的治療效果，考慮用藥成本，推薦劑量以B組劑量為宜。

2.3 平均增重 與E組相比，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，F(xiàn)組的體重、平均增重和平均增重率均顯著降低(P<0.05)。與F組相比，各用藥組的體重、平均增重和平均增重率均顯著增高(P<0.05)。與D組相比，A、B組的體重顯著增高(P<0.05)，平均增重和平均增重率均差異不顯著(P>0.05)，C組的體重、平均增重和平均增重率均顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)表4)。試驗(yàn)結(jié)果表明，A、B組對(duì)人工感染IB雞的增重有較好的促進(jìn)作用，考慮用藥成本，推薦B組劑量為臨床最佳使用劑量。

2.4 免疫器官指數(shù) 由圖1可知，雛雞感染IBV第6、9、12天和第15天時(shí)，與E組相比，F(xiàn)組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。與F組相比，各用藥組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均有升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)，在感染第12天和第15天時(shí)，A組的法氏囊指數(shù)均顯著升高(P<0.05)。與D組相比，各用藥組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。整體來(lái)看，A、B組的免疫器官指數(shù)升高的趨勢(shì)較大。

表3 抗病毒顆粒對(duì)人工感染雞傳染性支氣管炎的療效

注：不同組中，用相同字母標(biāo)注的數(shù)值表示差異性不顯著(P>0.05)；不同字母標(biāo)注的數(shù)值表示差異顯著(P<0.05)；下同

表4 抗病毒顆粒對(duì)雞體重的影響

圖1 抗病毒顆粒對(duì)雞免疫器官指數(shù)的影響

注：數(shù)據(jù)采用Mean±standard errors mean(SEM)的形式；不同的小寫(xiě)字母(a、b、c、d)表示各組之間差異顯著(P<0.05)；下同

2.5 病理剖檢和組織病理學(xué)觀察 整體來(lái)看，在病毒感染的不同時(shí)間段，F(xiàn)組的器官病變程度均最嚴(yán)重，主要病變?cè)跉夤堋⒑眍^、肺和胸腺。經(jīng)用藥治療后，各用藥組的病變均有不同程度的改善，其中，以A、B組的改善程度較為顯著。

試驗(yàn)雞氣管組織病理學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)中插彩版圖2。如圖所示，E組氣管組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)任何病理變化(見(jiàn)中插彩版圖2a)。F組在感染后黏膜水腫，上皮細(xì)胞及氣管纖毛嚴(yán)重脫落，可見(jiàn)固有層腺體細(xì)胞崩解、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增生，氣管腔內(nèi)有脫落的上皮細(xì)胞及滲出的紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(中插彩版圖2b)。A、B組可明顯觀察到上皮細(xì)胞、腺體結(jié)構(gòu)的再生，固有層浸潤(rùn)增生的炎性細(xì)胞顯著減少，僅有少量的出血現(xiàn)象(中插彩版圖2c、2d)。C組出現(xiàn)再生的上皮細(xì)胞，黏膜層開(kāi)始形成不規(guī)則的黏液腺，仍可見(jiàn)氣管腔內(nèi)脫落的上皮細(xì)胞、滲出的淋巴細(xì)胞及紅細(xì)胞(中插彩版圖2e)。D組上皮細(xì)胞再生明顯，腺細(xì)胞有逐漸形成腺體的趨向，一些上皮細(xì)胞已分化形成柱狀，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和出血現(xiàn)象明顯減少(中插彩版圖2f)。

圖2 各組雞氣管組織病理學(xué)變化 (H.E.染色，400×)

試驗(yàn)雞肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)中插彩版圖3。如圖所示，E組的肺組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)任何病理變化(見(jiàn)中插彩版圖3a)。F組在感染后，肺內(nèi)各級(jí)支氣管明顯擴(kuò)張，支氣管黏膜腫脹，固有層水腫、充血及出血，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞和異嗜性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落的上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞及炎性滲出物(中插彩版圖3b)?？共《绢w粒各劑量組用藥后均有不同程度的好轉(zhuǎn)，A、B組改善最為顯著，可見(jiàn)固有層、肺泡中炎性滲出和紅細(xì)胞滲出明顯減少，上皮細(xì)胞再生程度明顯，肺泡分布均勻結(jié)構(gòu)開(kāi)始趨于完整(中插彩版圖3c、3d、3e)。D組與A、B組效果無(wú)明顯差異(中插彩版圖3f)。

圖3 各組雞肺臟組織病理學(xué)變化 (H.E.染色，400×)

2.6 靶器官中IBVN基因拷貝數(shù)及IFN-β的表達(dá) 由圖4可知，雛雞感染IBV第6、9、12天和第15天時(shí)，與E組相比，F(xiàn)組氣管、支氣管、肺臟中IBVN基因的拷貝數(shù)均顯著增高(P<0.05)。與F組相比，各用藥組氣管、支氣管、肺臟中IBVN基因的拷貝數(shù)均顯著降低(P<0.05)。與D組相比，各用藥組氣管、支氣管、肺臟中IBVN基因的拷貝數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。在感染IBV第6天時(shí)，氣管中A組IBVN基因的拷貝數(shù)顯著低于C組(P<0.05)，在感染第12天時(shí)，支氣管中A組IBVN基因的拷貝數(shù)顯著低于C組(P<0.05)，在感染第9天時(shí)，肺臟中A組IBVN基因的拷貝數(shù)顯著低于C組(P<0.05)，其他各組均差異不顯著(P>0.05)。

各試驗(yàn)組均檢測(cè)到IFN-β的表達(dá)。與E組相比，F(xiàn)組IFN-β的表達(dá)有上升趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。與F組相比，A、B組能顯著上調(diào)IFN-β的表達(dá)(P<0.05)，優(yōu)于C、D組(P>0.05)。與D組相比，A組能顯著上調(diào)IFN-β的表達(dá)(P<0.05)，其他各藥物組相比，均無(wú)明顯差異(P>0.05)。

圖4 抗病毒顆粒對(duì)雞氣管、支氣管、肺臟中IBVN基因拷貝數(shù)及氣管中IFN-β表達(dá)量的影響

3 討論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，IB是熱毒入侵肺經(jīng)所致，肺氣不宣，則呼吸不暢導(dǎo)致咳喘，肺氣清肅，肺失肅降，肺氣則會(huì)上逆，同樣造成咳喘，從而導(dǎo)致脾運(yùn)化受阻，肝腎氣血不足，最終咳喘加重。因此臨證中通常選用清熱解毒、理氣宣肺和止咳化痰平喘的方法進(jìn)行治療[10]。本試驗(yàn)采用抗病毒顆粒，方中板藍(lán)根、連翹、石膏、地黃、郁金和知母等諸藥合用具有涼血解毒、清熱祛濕和止咳平喘的功效。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：按8 g/L和4 g/L的劑量連續(xù)5 d通過(guò)飲水給予抗病毒顆粒，對(duì)人工感染IB雞只治療的總有效率分別為90.00%和86.67%，痊愈率分別為80.00%和76.67%，死亡率分別降低為10.00%和13.33%，說(shuō)明抗病毒顆粒對(duì)人工感染IB有顯著的治療作用。

胸腺作為機(jī)體重要的淋巴器官，是T淋巴細(xì)胞增殖與分化的場(chǎng)所，對(duì)細(xì)胞免疫功能具有重要意義。脾臟是機(jī)體內(nèi)最大的外周免疫器官，脾指數(shù)的增加可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增殖和B細(xì)胞抗體的分泌。法氏囊是禽類(lèi)特有的免疫器官，發(fā)揮著免疫中樞的作用，為B細(xì)胞分化與成熟提供場(chǎng)所[11-12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：在雛雞感染IBV第6 、9 、12天和第15天時(shí)，各用藥組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)與F組相比，均有升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。在感染IBV第12天和第15天時(shí)，與F組相比，A組的法氏囊指數(shù)均顯著升高(P<0.05)，其余各組的法氏囊指數(shù)均有升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。表明A、B組可以增加免疫器官指數(shù)，增強(qiáng)感染雞機(jī)體免疫力。

IBV感染周期中，N蛋白的主要功能為包裹病毒基因組RNA形成核衣殼，且參與病毒RNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及宿主細(xì)胞代謝的調(diào)控以促進(jìn)病毒復(fù)制[13]。在感染的細(xì)胞中，N蛋白能夠定位于細(xì)胞漿、細(xì)胞核以及核仁中，定位于核仁的N蛋白可能干擾宿主細(xì)胞的翻譯以及細(xì)胞周期，并促進(jìn)病毒RNA的翻譯[14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：在雛雞感染IBV第6 、9 、12天和第15天時(shí)，與F組相比，各用藥組氣管、支氣管、肺臟中IBVN基因的拷貝數(shù)均顯著降低(P<0.05)，與D組相比，抗病毒顆粒各劑量組各組織IBV N基因的拷貝數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。因此，抗病毒顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制N蛋白的表達(dá)，以抑制病毒在宿主細(xì)胞復(fù)制的多個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，最終抑制IBV在宿主細(xì)胞的復(fù)制。

干擾素是一類(lèi)生物學(xué)活性廣泛的細(xì)胞因子，其中Ⅰ型干擾素在機(jī)體天然免疫過(guò)程中具有重要作用，能夠抑制病毒復(fù)制、腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力。病毒侵入機(jī)體后可被機(jī)體模式識(shí)別受體識(shí)別，激活機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，IFN-β屬于Ⅰ型干擾素，在抗病毒感染中發(fā)揮重要的作用[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：抗病毒顆?？烧T生IFN-β，且A、B組能顯著上調(diào)IFN-β的表達(dá)，優(yōu)于D組。

4 結(jié)論

抗病毒顆粒對(duì)IB具有顯著的治療作用，既可直接抑制IBVN基因復(fù)制，又可增強(qiáng)機(jī)體免疫器官指數(shù)、增加IFN-β表達(dá)，從而抑制病毒增殖。綜合考慮用藥成本和臨床療效，推薦按4 g/L的劑量在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。