張傳美，徐塵楓，鄒 玲，賀西軍，楊海燕，單 虎

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島266109 ； 2.山東省日照市畜牧開(kāi)發(fā)服務(wù)站，山東日照276800)

腹瀉(Diarrhea)是一種常見(jiàn)癥狀，在犬上最常發(fā)生，引起犬腹瀉的原因很多，如病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)，還有食物中毒、藥物中毒、營(yíng)養(yǎng)性原因等都可引起腹瀉。其中細(xì)菌性感染引起的犬腹瀉較常見(jiàn)，占所有腹瀉病例數(shù)的30%以上[1-2]。引起犬腹瀉的致病菌包活大腸桿菌、沙門(mén)菌、彎曲桿菌、志賀菌等[3]。犬與人朝夕相處，關(guān)系密切，在人和動(dòng)物之間細(xì)菌耐藥性傳播中起到重要的作用，因?yàn)樗鼈兪褂玫闹委熕幬镆才c人類(lèi)相似，所以，犬源耐藥菌很容易轉(zhuǎn)移到人源細(xì)菌中，犬作為耐藥菌貯存宿主的問(wèn)題需要得到更多關(guān)注。隨著各類(lèi)抗菌藥在臨床治療上的廣泛應(yīng)用，耐藥性的問(wèn)題愈來(lái)愈嚴(yán)重，研究表明，犬?dāng)y帶的人獸共患病病原菌呈現(xiàn)耐藥性升高的趨勢(shì)，且耐藥譜也越來(lái)越廣[4]。本試驗(yàn)對(duì)腹瀉病犬的腸道菌進(jìn)行分離鑒定、藥敏試驗(yàn)及耐藥性分析，了解犬源分離菌株的耐藥情況，以期為臨床合理用藥和耐藥情況監(jiān)測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、LB肉湯、革蘭染色劑等,均購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；符合YY/T1191-2011標(biāo)準(zhǔn)的藥敏紙片，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；DNA Marker、Mixture PCR(酶)，均購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 細(xì)菌的分離、純化 無(wú)菌采集臨床上9例患有腹瀉癥狀的病犬的肛門(mén)拭子，將肛拭子劃線接種于TSA培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況及菌落特征。將具有不同典型特征的單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，并革蘭染色鏡檢。

1.3 16S rDNA鑒定 經(jīng)純培養(yǎng)的細(xì)菌，使用細(xì)菌DNA柱式提取試劑盒提取DNA，合成16S rDNA通用引物，上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。目的片段為1 428 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μL，Mix PCR(2×)酶12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，超純水8.5 μL。PCR的反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，鑒定陽(yáng)性后送青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定其所屬菌種。

1.4 藥敏試驗(yàn) 選用3大類(lèi)抗菌藥物，包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)：頭孢曲松、頭孢他啶、氨芐西林；氨基糖苷類(lèi)：阿米卡星、慶大霉素；氟喹諾酮類(lèi)：恩諾沙星、環(huán)丙沙星共7種藥敏紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，平行試驗(yàn)3次，計(jì)算其平均值，結(jié)果按臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.5 耐藥基因檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)發(fā)表序列(表1)，使用PCR方法檢測(cè)耐藥基因，引物合成和測(cè)序均由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。

表1 耐藥基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果 從9例臨床病例中分離出12株典型的菌株，其中8株具有腸桿菌特征，3株具有假單胞菌特征，1株具有腸球菌特征。12株分離菌純培養(yǎng)菌落使用16S rDNA通用引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后，均得到大小為1 428 bp的目的條帶，與預(yù)期的結(jié)果相同。測(cè)序?qū)Ρ冉Y(jié)果表明：菌株1～8為大腸桿菌，菌株9～11為銅綠假單胞菌，菌株12為糞腸球菌。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。β-內(nèi)酰胺類(lèi)3種藥物中，除1株大腸桿菌對(duì)頭孢他啶耐藥外，其余菌株對(duì)頭孢曲松和頭孢他啶均敏感，但對(duì)氨芐西林耐藥率高，達(dá)91.7%。氨基糖苷類(lèi)2種藥物中，對(duì)阿米卡星耐藥率低，對(duì)慶大霉素耐藥率高，達(dá)83.3%。氟喹諾酮類(lèi)2種藥物中，對(duì)環(huán)丙沙星耐藥率低，對(duì)恩諾沙星耐藥率較高，為41.7%。

圖1 分離株16S rDNA基因PCR結(jié)果

M：DL-2 000 DNA Marker ；-：陰性對(duì)照 ； 1～12：分離菌株

表2 分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

S： 敏感 ； I： 中度敏感 ； R： 耐藥

2.3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 β-內(nèi)酰胺酶基因和ESBL-抗生素耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaTEM和blaSHV檢出率均為100%。ESBL-抗生素耐藥基因blaCTX-M-8的檢出率為83.3%，2號(hào)大腸桿菌與12號(hào)糞腸球菌未檢測(cè)到ESBL-抗生素耐藥基因blaCTX-M-8(圖2，表3)。

圖2 分離株blaTEM、blaSHV基因PCR結(jié)果

M：DL-1 000 DNA Marker ；-：陰性對(duì)照 ； 1～8：8株大腸桿菌分離株 ；9～11：3株銅綠假單胞菌分離株 ； 12：1株糞腸球菌分離株

2.3.2 氨基糖苷類(lèi)耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 12株分離株，氨基糖苷類(lèi)耐藥基因中基因aac(3)-II的檢出率為100%。aac(6’)-Ib基因檢出率為66.7%，8株大腸桿菌中有4株未檢測(cè)到該基因，3株綠膿桿菌和1株糞腸球菌均檢測(cè)到該基因?；騛acC2檢出率為41.7%，8株大腸桿菌中僅有1株檢測(cè)到該基因，3株綠膿桿菌和1株糞腸球菌均檢測(cè)到該基因(圖3，表3)。

圖3 分離株aac(3)-II、aac(6’)-Ib、aacC2基因PCR結(jié)果

M：DL-1 000 DNA Marker；-：陰性對(duì)照 ； 1～8：8株大腸桿菌分離株； 9～11 ： 3株銅綠假單胞菌分離株 ; 12：1株糞腸球菌分離株

2.3.3 氟喹諾酮類(lèi)耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 12株分離菌株中，氟喹諾酮類(lèi)耐藥基因qnrS的檢出率為83.3%，僅有1株大腸桿菌與1株糞腸球菌未檢測(cè)到該基因。qepA的檢出率為58.3%，1株大腸桿菌與3株綠膿桿菌、1株糞腸球菌未檢測(cè)到該基因(圖4，表3)。

3 討論

本試驗(yàn)從臨床9例有腹瀉癥狀的病犬的肛拭子中分離得到12株菌株，根據(jù)菌落特征、革蘭染色和16S rDNA序列分析，鑒定出8株大腸桿菌，3株銅綠假單胞菌和1株糞腸球菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，12株分離菌株對(duì)臨床常用的3大類(lèi)抗菌藥物均產(chǎn)生了耐藥性，對(duì)氨芐西林、慶大霉素和恩諾沙星耐藥率較高，且呈現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象，所以在臨床治療時(shí)，要注意使用敏感的藥物，否則不僅治療失敗，而且會(huì)增加耐藥菌產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。

表3 12株分離菌株各耐藥基因檢出率

圖4 分離株qnrS、qepA基因PCR結(jié)果

M：DL-2 000 DNA Marker； -：陰性對(duì)照； 1～8：8株大腸桿菌分離株 ;9～11： 3株銅綠假單胞菌分離株 ; 12：1株糞腸球菌分離株

本試驗(yàn)檢測(cè)的β-內(nèi)酰胺酶基因blaTEM和blaSHV會(huì)使細(xì)菌表達(dá)并生成β-內(nèi)酰胺酶，該酶能夠水解β-內(nèi)酰胺環(huán)上的酰胺鏈，從而使藥物失活[10]。氨芐西林作為臨床經(jīng)典藥物和常用藥，常用于寵物臨床，所以產(chǎn)生了較高的耐藥性，而頭孢曲松和頭孢他啶為較新型的第3代頭孢類(lèi)藥物，臨床還未產(chǎn)生較高的耐藥性，這與代鵬飛等[11]所提供的動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)氨芐西林耐藥率較高，而對(duì)頭孢類(lèi)藥物敏感的結(jié)果基本一致。近些年，產(chǎn)生超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases，ESBLs)導(dǎo)致革蘭陰性菌的耐藥性加劇[12]，本試驗(yàn)也顯示12株分離菌株中，有10株檢測(cè)到ESBL-抗生素耐藥基因blaCTX-M-8，說(shuō)明產(chǎn)ESBL腸桿菌的耐藥問(wèn)題也要在犬上引起注意。氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aac(3)-Ⅱ，aac(6′)-Ib和aacC2 都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)產(chǎn)生氨基糖苷類(lèi)鈍化酶，編輯該酶的遺傳物質(zhì)還可在菌體中互相傳遞，使耐藥菌逐步增多[13]。氟喹諾酮類(lèi)耐藥基因qnrS和qepA產(chǎn)生細(xì)菌 DNA 回旋酶保護(hù)蛋白是其具有耐藥性的重要原因。本試驗(yàn)中分離菌對(duì)3大類(lèi)耐藥基因的檢出率高達(dá)40%以上，說(shuō)明寵物犬臨床上這幾類(lèi)藥物的耐藥性的問(wèn)題不容忽視。我們除了要重視犬疾病的防控外，還應(yīng)做好寵物臨床用藥的管控與監(jiān)測(cè)，以促進(jìn)寵物行業(yè)健康發(fā)展。