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        基于細(xì)胞自噬機(jī)制探討祛風(fēng)生脈顆粒保護(hù)血管內(nèi)皮的研究

        2019-05-20 10:04:12馬培澤孫正新2姜月華3
        關(guān)鍵詞:生脈小體孵育

        馬培澤,孫正新2,楊 春,姜月華3,呂 娟

        細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下,適度的自噬能夠促進(jìn)細(xì)胞自我吞食,保護(hù)細(xì)胞抵抗不利環(huán)境,促進(jìn)細(xì)胞存活,而過(guò)度自噬則誘導(dǎo)細(xì)胞走向程序性死亡[1-4]。心肌缺血時(shí),自噬活性的改變很可能影響血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能,而血管內(nèi)皮細(xì)胞功能改變與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),因此,研究自噬在缺血心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)缺血損傷中的作用,將有助于發(fā)現(xiàn)新的方法應(yīng)用于缺血性疾病的治療。過(guò)去的研究多集中于對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù),而忽視了對(duì)CMECs缺血損傷的關(guān)注。迄今為止,自噬在缺血CMECs的作用尚未明確,基于細(xì)胞自噬探討中醫(yī)藥保護(hù)血管內(nèi)皮的作用,鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此,本課題在原有研究基礎(chǔ)上,建立缺血CMECs模型,基于細(xì)胞自噬探討中醫(yī)藥保護(hù)血管內(nèi)皮的干預(yù)效應(yīng)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF級(jí)6周齡雄性SD大鼠,體重220~280 g,45只,由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供。所有大鼠均采用籠養(yǎng),生存在明暗各12 h飼養(yǎng)環(huán)境中。

        1.2 主要儀器 流式細(xì)胞儀(德國(guó)Beckman公司),酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司),低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司),透射電鏡(日本JEOL公司),CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Heraeus公司),心電圖機(jī)(北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司),呼吸機(jī)(美國(guó)BIRD公司),BIO-RAD電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司),Axiovert 40C倒置相差顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司),BIO-RAD半干轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)BIO-RAD公司),LAS-4000型化學(xué)發(fā)光及熒光影像分析儀(日本FUJIFILM公司)。

        1.3 藥品與試劑 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(杭州聯(lián)科生物有限公司),3甲基腺嘌呤(3-MA,美國(guó)Sigma-Aldrich),雷帕霉素(美國(guó)Cell Signal Technology),祛風(fēng)生脈顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司),DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司),胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司),PBS平衡液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),0.25%胰蛋白酶(北京Solarbio公司),Western-blot所用試劑(北京Solarbio公司)。

        1.4 實(shí)驗(yàn)方法

        1.4.1 動(dòng)物灌胃及血清制備 選取雄性SD大鼠(220~280 g)5只。祛風(fēng)生脈顆粒2 g/(kg·d),每只大鼠每日上午灌胃1 次,每次4 mL,連續(xù)5 d。于第5日末次灌胃3 h 后打開(kāi)腹腔,在大鼠腹主動(dòng)脈插管,無(wú)菌取血,置無(wú)菌不抗凝管中,室溫下靜置3~4 h,1 500 r/min離心20 min,吸上清液,無(wú)菌分離血清并混合,過(guò)濾后置于無(wú)菌試管中,制備成祛風(fēng)生脈顆粒大鼠含藥血清,于-20 ℃冰箱保存。

        1.4.2 大鼠急性心肌梗死模型建立 選取雄性SD大鼠(220~280 g)32只,采用結(jié)扎法制作大鼠急性心肌梗死模型[5]。記錄心電圖出現(xiàn)Q波、ST段抬高、T波高聳或倒置,證實(shí)結(jié)扎成功。術(shù)后存活24 h即為造模成功。

        1.4.3 培養(yǎng)大鼠缺血/正常CMECs 選取造模成功的急性心肌梗死模型大鼠32只及正常SD大鼠8只,采用組織塊法分別培養(yǎng)大鼠缺血/正常CMECs[5]。組織塊周?chē)囵B(yǎng)出大量細(xì)胞,去除組織塊,繼續(xù)培養(yǎng),3 d換液1次,直到細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合時(shí)進(jìn)行傳代,實(shí)驗(yàn)均選取二代細(xì)胞進(jìn)行。

        1.4.4 分組及藥物干預(yù) 將成功培養(yǎng)的大鼠缺血CMECs隨機(jī)分為4組:缺血組(QX組)、缺血+雷帕霉素組(QX+RAPA組)、缺血+3-甲基腺嘌呤組(QX+3-MA組)和缺血+祛風(fēng)生脈顆粒組(QX+QF組)。并將正常大鼠CMECs作為正常組(ZC組)。QX組和ZC組細(xì)胞均給予含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),QX+RAPA組在上述培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,加入濃度為10 nmol/L的自噬促進(jìn)劑雷帕霉素,QX+3-MA組加入濃度為5 mmol/L的自噬抑制劑3-MA,QX+QF組給予祛風(fēng)生脈顆粒大鼠含藥血清,與缺血CMECs共孵育,培養(yǎng)24 h。

        1.5 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

        1.5.1 透射電鏡觀察自噬小體 取各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底的80%,消化、離心,小心吸取上清液,向細(xì)胞團(tuán)塊中緩緩加入1.5 mL 3%戊二醛固定液進(jìn)行固定,4 ℃保存,后進(jìn)行雙固定、脫水、浸透、包埋、切片,調(diào)試電鏡,觀察自噬小體以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

        1.5.2 Western-blot分析LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及P62蛋白表達(dá) 與上述分組一樣,分別取5組生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,棄培養(yǎng)液,PBS洗滌后加入細(xì)胞裂解液,提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度[3],根據(jù)總上樣量和各組樣本蛋白濃度計(jì)算各組樣本所需樣本量。將樣品液和預(yù)染蛋白標(biāo)記分別上樣,電泳分離蛋白,參照半干轉(zhuǎn)膜儀說(shuō)明組裝濾紙凝膠纖維素夾層,轉(zhuǎn)印蛋白,于5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育1 h以封閉膜上的非特異結(jié)合,封閉過(guò)的膜加入合適濃度一抗,抗原抗體結(jié)合,4 ℃孵育過(guò)夜,加入HRP標(biāo)記的二抗以結(jié)合一抗,室溫孵育1 h,加入顯色劑,膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育,應(yīng)用LAS-4000型化學(xué)發(fā)光及熒光影像分析儀曝光顯影,圖片掃描。應(yīng)用Gel-Pro軟件分析數(shù)字化圖像上每個(gè)特異條帶的灰度值。各組樣本目的蛋白的灰度值除以?xún)?nèi)參的灰度值以校正誤差,所得數(shù)值為各組樣本目的蛋白的相對(duì)含量。

        1.5.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 0.25%胰酶消化細(xì)胞,將每個(gè)樣本細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×106~5×106個(gè),1000r/min離心5min,棄上清,PBS洗滌2次,1000 r/min離心5 min,棄上清,每個(gè)樣本用約500 μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞;每個(gè)樣本中分別加入5 μL的Annexin V-FITC和106的PI;避光搖勻后黑暗中室溫孵育5 min;1 h內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析結(jié)果。

        1.5.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1) 加藥干預(yù)后用無(wú)菌EP管收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按照酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。取5支干凈的EP管,并于每管中加入150 μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,分別設(shè)空白孔(不加樣,只加顯色劑A、B和終止液)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔和零孔(將其作為標(biāo)曲的最后一個(gè)點(diǎn)),并做記錄。標(biāo)準(zhǔn)品孔:每孔加入制備好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL,后加入生物素抗原工作液50 μL。樣品孔:先加入相應(yīng)大鼠血清樣品50 μL,后加入生物素抗原工作液50 μL。零孔:先加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液50 μL,后加入生物素抗原工作液50 μL。以上各孔均做好相應(yīng)記錄,輕輕搖晃后貼上封板膜,置于37 ℃恒溫箱中60 min。輕輕揭掉封板膜,棄去液體,甩干,放入洗板機(jī)內(nèi)洗板,洗板5次后取出酶標(biāo)板,拍干。每孔中先后分別加入顯色劑A 50 μL、顯色劑B 50 μL,小心搖晃,置于37 ℃保溫箱中避光10 min。取出酶標(biāo)板,每孔加入終止液50 μL以終止反應(yīng)(藍(lán)色立即轉(zhuǎn)為黃色)。將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中,以空白孔調(diào)零,波長(zhǎng)為450 nm測(cè)量各孔的吸光度值(此步驟應(yīng)于10 min內(nèi)進(jìn)行)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,在此基礎(chǔ)上根據(jù)樣品的吸光度值計(jì)算出不同樣品所對(duì)應(yīng)的濃度。

        2 結(jié) 果

        2.1 透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬小體及超微結(jié)構(gòu)變化 透射電鏡下,ZC組細(xì)胞質(zhì)均勻,細(xì)胞內(nèi)空泡少,核染色質(zhì)均勻分布;QX組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可以見(jiàn)到大小不等的雙層膜或多層膜自噬體結(jié)構(gòu),線粒體形態(tài)腫脹變形;QX+RAPA組自噬體的聚集趨于增多,自噬體中包含部分細(xì)胞質(zhì)成分,QX+3-MA組自噬體數(shù)目明顯減少。QX+QF組自噬小體聚集更加明顯,同時(shí)還觀察到數(shù)目較多的自噬溶酶體,自噬溶酶體中包含部分胞質(zhì)成分以及尚未消化的細(xì)胞器。詳見(jiàn)圖1。

        A為ZC組;B為QX組;C為QX+RAPA組;D為QX+3-MA組;E為QX+QF組。圖中白色箭頭所示為核仁,黑色實(shí)心箭頭所示為自噬小體,黑色空心箭頭所示為自噬溶酶體

        2.2 各組細(xì)胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值情況比較 Western blot 結(jié)果表明:QX組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值高于ZC組和QX+3-MA組(P<0.05);與QX組和QX+3-MA組比較,QX+RAPA組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值進(jìn)一步升高(P均 <0.05),與QX組相比,QX+QF組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高(P<0.01)。詳見(jiàn)表1。

        表1各組細(xì)胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值情況(±s)

        與ZC組比較,1)P<0.05;與QX組比較,2)P<0.05;與QX+3-MA組比較,3)P<0.05,4)P<0.01

        2.3 各組細(xì)胞凋亡情況比較 QX組總凋亡率高于ZC組(P<0.05);與QX組和QX+3-MA組比較,QX+RAPA組總凋亡率明顯降低(P均<0.05),與QX組相比,QX+QF組總凋亡率顯著降低(P<0.01)。詳見(jiàn)圖2、表2。

        圖2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

        表2各組CMECs凋亡情況比較(±s) %

        與ZC組比較,1)P<0.05; 與QX組比較,2)P<0.05;與QX+3-MA組比較,3)P<0.05,4)P<0.01

        2.4 各組細(xì)胞內(nèi)皮功能變化 QX組ET-1水平比ZC組升高(P<0.01);QX+RAPA組ET-1水平比QX組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);QX+3-MA組ET-1水平比QX組升高(P<0.05);QX+QF組ET-1水平比QX組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。QX組NO水平比ZC組升高(P<0.01);QX+RAPA組NO水平比QX組降低(P<0.05);QX+3-MA組NO水平比QX組升高(P<0.05);QX+QF組NO水平比QX組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表3。

        表3各組細(xì)胞內(nèi)皮功能變化比較(±s)

        與ZC組比較,1)P<0.01;與QX組比較,2)P<0.05;3)P<0.01

        3 討 論

        “損傷反應(yīng)”學(xué)說(shuō)認(rèn)為,血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是冠心病心肌缺血發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。然而,目前對(duì)于CMECs缺血損傷的關(guān)注遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于心肌細(xì)胞本身。

        自噬作為細(xì)胞應(yīng)對(duì)損傷的一種保護(hù)性反應(yīng),對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及生理功能有著非常重要的作用[6-9]。推測(cè)自噬可能是防止血管內(nèi)皮缺血損傷的一種潛在機(jī)制,有可能成為心血管疾病治療的新靶點(diǎn)和新策略。Xie等[10]用AGEs修飾的牛血清白蛋白AGEs-BSA培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),發(fā)現(xiàn)AGEs-BSA 在作用早期可以提高 HUVECs 的自噬水平而抵抗損傷。Han等[11]發(fā)現(xiàn)預(yù)孵育姜黃素能誘導(dǎo)HUVECs自噬,顯著增加過(guò)氧化氫處理HUVECs的生存能力。張艷林等[12]用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激內(nèi)皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)ox-LDL可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,同時(shí)乳酸脫氫酶(LDH)和ET-1的分泌增加說(shuō)明細(xì)胞受到損傷,而這種損傷可被自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素所降低,被自噬抑制劑3-MA所增強(qiáng),提示自噬在ox-LDL導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中起保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn),缺血CMECs能夠發(fā)生自噬,但是細(xì)胞凋亡增加,內(nèi)皮功能受到損傷,雷帕霉素干預(yù)后的缺血CMECs,電鏡下觀察到自噬小體數(shù)目增多,細(xì)胞凋亡減少,內(nèi)皮功能得到改善,缺血CMECs的自噬流是受到抑制的,整個(gè)自噬過(guò)程是存在障礙的,這種障礙很有可能發(fā)生在自噬溶酶體的環(huán)節(jié)。

        根據(jù)冠心病“本虛標(biāo)實(shí)”的基本病機(jī),結(jié)合戴國(guó)華教授提出的冠心病“風(fēng)病”學(xué)說(shuō),認(rèn)為心腎陽(yáng)虛、氣血失調(diào)是冠心病發(fā)病的基礎(chǔ),風(fēng)邪是冠心病重要的致病因素,脈滯風(fēng)阻是冠心病發(fā)作的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。確立了祛風(fēng)活血通絡(luò)、補(bǔ)腎益氣生脈的治療方法,研制成中藥?kù)铒L(fēng)生脈顆粒,從風(fēng)邪論治冠心病有著豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),且對(duì)安全性的顧慮較少。用祛風(fēng)生脈顆粒大鼠含藥血清,與缺血CMECs共孵育,電鏡下觀察到自噬小體數(shù)目明顯增多,同時(shí)觀察到較多的自噬溶酶體,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高,細(xì)胞總凋亡率明顯減少,ET-1水平降低(P<0.01),提示祛風(fēng)生脈顆粒干預(yù)后不僅促進(jìn)了自噬小體的生成,而且促進(jìn)了整個(gè)自噬流,包括自噬溶酶體的生成,達(dá)到減少細(xì)胞凋亡,改善內(nèi)皮功能的干預(yù)效應(yīng)。至于祛風(fēng)生脈顆粒調(diào)控自噬的分子機(jī)制,尚需要進(jìn)一步深入研究。

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