馬培澤，孫正新2，楊 春，姜月華3，呂 娟

細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下，適度的自噬能夠促進(jìn)細(xì)胞自我吞食，保護(hù)細(xì)胞抵抗不利環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞存活，而過度自噬則誘導(dǎo)細(xì)胞走向程序性死亡[1-4]。心肌缺血時，自噬活性的改變很可能影響血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能，而血管內(nèi)皮細(xì)胞功能改變與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此，研究自噬在缺血心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)缺血損傷中的作用，將有助于發(fā)現(xiàn)新的方法應(yīng)用于缺血性疾病的治療。過去的研究多集中于對心肌細(xì)胞的保護(hù)，而忽視了對CMECs缺血損傷的關(guān)注。迄今為止，自噬在缺血CMECs的作用尚未明確，基于細(xì)胞自噬探討中醫(yī)藥保護(hù)血管內(nèi)皮的作用，鮮見報(bào)道。鑒于此，本課題在原有研究基礎(chǔ)上，建立缺血CMECs模型，基于細(xì)胞自噬探討中醫(yī)藥保護(hù)血管內(nèi)皮的干預(yù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用SPF級6周齡雄性SD大鼠，體重220～280 g，45只，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供。所有大鼠均采用籠養(yǎng)，生存在明暗各12 h飼養(yǎng)環(huán)境中。

1.2 主要儀器 流式細(xì)胞儀(德國Beckman公司)，酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)，低溫高速離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)，透射電鏡(日本JEOL公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Heraeus公司)，心電圖機(jī)(北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司)，呼吸機(jī)(美國BIRD公司)，BIO-RAD電泳儀(美國BIO-RAD公司)，Axiovert 40C倒置相差顯微鏡(德國Zeiss公司)，BIO-RAD半干轉(zhuǎn)膜儀(美國BIO-RAD公司)，LAS-4000型化學(xué)發(fā)光及熒光影像分析儀(日本FUJIFILM公司)。

1.3 藥品與試劑 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(杭州聯(lián)科生物有限公司)，3甲基腺嘌呤(3-MA，美國Sigma-Aldrich)，雷帕霉素(美國Cell Signal Technology)，祛風(fēng)生脈顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，PBS平衡液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，0.25%胰蛋白酶(北京Solarbio公司)，Western-blot所用試劑(北京Solarbio公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動物灌胃及血清制備 選取雄性SD大鼠(220～280 g)5只。祛風(fēng)生脈顆粒2 g/(kg·d)，每只大鼠每日上午灌胃1 次，每次4 mL，連續(xù)5 d。于第5日末次灌胃3 h 后打開腹腔，在大鼠腹主動脈插管，無菌取血，置無菌不抗凝管中，室溫下靜置3～4 h，1 500 r/min離心20 min，吸上清液，無菌分離血清并混合，過濾后置于無菌試管中，制備成祛風(fēng)生脈顆粒大鼠含藥血清，于-20 ℃冰箱保存。

1.4.2 大鼠急性心肌梗死模型建立 選取雄性SD大鼠(220～280 g)32只，采用結(jié)扎法制作大鼠急性心肌梗死模型[5]。記錄心電圖出現(xiàn)Q波、ST段抬高、T波高聳或倒置，證實(shí)結(jié)扎成功。術(shù)后存活24 h即為造模成功。

1.4.3 培養(yǎng)大鼠缺血/正常CMECs 選取造模成功的急性心肌梗死模型大鼠32只及正常SD大鼠8只，采用組織塊法分別培養(yǎng)大鼠缺血/正常CMECs[5]。組織塊周圍培養(yǎng)出大量細(xì)胞，去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)，3 d換液1次，直到細(xì)胞生長至近融合時進(jìn)行傳代，實(shí)驗(yàn)均選取二代細(xì)胞進(jìn)行。

1.4.4 分組及藥物干預(yù) 將成功培養(yǎng)的大鼠缺血CMECs隨機(jī)分為4組：缺血組(QX組)、缺血+雷帕霉素組(QX+RAPA組)、缺血+3-甲基腺嘌呤組(QX+3-MA組)和缺血+祛風(fēng)生脈顆粒組(QX+QF組)。并將正常大鼠CMECs作為正常組(ZC組)。QX組和ZC組細(xì)胞均給予含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，QX+RAPA組在上述培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，加入濃度為10 nmol/L的自噬促進(jìn)劑雷帕霉素，QX+3-MA組加入濃度為5 mmol/L的自噬抑制劑3-MA，QX+QF組給予祛風(fēng)生脈顆粒大鼠含藥血清，與缺血CMECs共孵育，培養(yǎng)24 h。

1.5 觀察指標(biāo)及測定方法

1.5.1 透射電鏡觀察自噬小體 取各組處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底的80%，消化、離心，小心吸取上清液，向細(xì)胞團(tuán)塊中緩緩加入1.5 mL 3%戊二醛固定液進(jìn)行固定，4 ℃保存，后進(jìn)行雙固定、脫水、浸透、包埋、切片，調(diào)試電鏡，觀察自噬小體以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.5.2 Western-blot分析LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及P62蛋白表達(dá) 與上述分組一樣，分別取5組生長至對數(shù)生長期的細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度[3]，根據(jù)總上樣量和各組樣本蛋白濃度計(jì)算各組樣本所需樣本量。將樣品液和預(yù)染蛋白標(biāo)記分別上樣，電泳分離蛋白，參照半干轉(zhuǎn)膜儀說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，轉(zhuǎn)印蛋白，于5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育1 h以封閉膜上的非特異結(jié)合，封閉過的膜加入合適濃度一抗，抗原抗體結(jié)合，4 ℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗以結(jié)合一抗，室溫孵育1 h，加入顯色劑，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，應(yīng)用LAS-4000型化學(xué)發(fā)光及熒光影像分析儀曝光顯影，圖片掃描。應(yīng)用Gel-Pro軟件分析數(shù)字化圖像上每個特異條帶的灰度值。各組樣本目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得數(shù)值為各組樣本目的蛋白的相對含量。

1.5.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 0.25%胰酶消化細(xì)胞，將每個樣本細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×106～5×106個，1000r/min離心5min，棄上清，PBS洗滌2次，1000 r/min離心5 min，棄上清，每個樣本用約500 μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞；每個樣本中分別加入5 μL的Annexin V-FITC和106的PI；避光搖勻后黑暗中室溫孵育5 min；1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測分析結(jié)果。

1.5.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1) 加藥干預(yù)后用無菌EP管收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。取5支干凈的EP管，并于每管中加入150 μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，分別設(shè)空白孔(不加樣，只加顯色劑A、B和終止液)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔和零孔(將其作為標(biāo)曲的最后一個點(diǎn))，并做記錄。標(biāo)準(zhǔn)品孔：每孔加入制備好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，后加入生物素抗原工作液50 μL。樣品孔：先加入相應(yīng)大鼠血清樣品50 μL，后加入生物素抗原工作液50 μL。零孔：先加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液50 μL，后加入生物素抗原工作液50 μL。以上各孔均做好相應(yīng)記錄，輕輕搖晃后貼上封板膜，置于37 ℃恒溫箱中60 min。輕輕揭掉封板膜，棄去液體，甩干，放入洗板機(jī)內(nèi)洗板，洗板5次后取出酶標(biāo)板，拍干。每孔中先后分別加入顯色劑A 50 μL、顯色劑B 50 μL，小心搖晃，置于37 ℃保溫箱中避光10 min。取出酶標(biāo)板，每孔加入終止液50 μL以終止反應(yīng)(藍(lán)色立即轉(zhuǎn)為黃色)。將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，以空白孔調(diào)零，波長為450 nm測量各孔的吸光度值(此步驟應(yīng)于10 min內(nèi)進(jìn)行)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，在此基礎(chǔ)上根據(jù)樣品的吸光度值計(jì)算出不同樣品所對應(yīng)的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬小體及超微結(jié)構(gòu)變化 透射電鏡下，ZC組細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞內(nèi)空泡少，核染色質(zhì)均勻分布；QX組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可以見到大小不等的雙層膜或多層膜自噬體結(jié)構(gòu)，線粒體形態(tài)腫脹變形；QX+RAPA組自噬體的聚集趨于增多，自噬體中包含部分細(xì)胞質(zhì)成分，QX+3-MA組自噬體數(shù)目明顯減少。QX+QF組自噬小體聚集更加明顯，同時還觀察到數(shù)目較多的自噬溶酶體，自噬溶酶體中包含部分胞質(zhì)成分以及尚未消化的細(xì)胞器。詳見圖1。

A為ZC組；B為QX組；C為QX+RAPA組；D為QX+3-MA組；E為QX+QF組。圖中白色箭頭所示為核仁，黑色實(shí)心箭頭所示為自噬小體，黑色空心箭頭所示為自噬溶酶體

2.2 各組細(xì)胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值情況比較 Western blot 結(jié)果表明：QX組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值高于ZC組和QX+3-MA組(P<0.05)；與QX組和QX+3-MA組比較，QX+RAPA組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值進(jìn)一步升高(P均 <0.05)，與QX組相比，QX+QF組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高(P<0.01)。詳見表1。

表1各組細(xì)胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值情況(±s)

與ZC組比較，1)P<0.05；與QX組比較，2)P<0.05；與QX+3-MA組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

2.3 各組細(xì)胞凋亡情況比較 QX組總凋亡率高于ZC組(P<0.05)；與QX組和QX+3-MA組比較，QX+RAPA組總凋亡率明顯降低(P均<0.05)，與QX組相比，QX+QF組總凋亡率顯著降低(P<0.01)。詳見圖2、表2。

圖2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況

表2各組CMECs凋亡情況比較(±s) %

與ZC組比較，1)P<0.05； 與QX組比較，2)P<0.05；與QX+3-MA組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

2.4 各組細(xì)胞內(nèi)皮功能變化 QX組ET-1水平比ZC組升高(P<0.01)；QX+RAPA組ET-1水平比QX組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；QX+3-MA組ET-1水平比QX組升高(P<0.05)；QX+QF組ET-1水平比QX組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。QX組NO水平比ZC組升高(P<0.01)；QX+RAPA組NO水平比QX組降低(P<0.05)；QX+3-MA組NO水平比QX組升高(P<0.05)；QX+QF組NO水平比QX組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表3。

表3各組細(xì)胞內(nèi)皮功能變化比較(±s)

與ZC組比較，1)P<0.01；與QX組比較，2)P<0.05；3)P<0.01

3 討 論

“損傷反應(yīng)”學(xué)說認(rèn)為，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是冠心病心肌缺血發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。然而，目前對于CMECs缺血損傷的關(guān)注遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于心肌細(xì)胞本身。

自噬作為細(xì)胞應(yīng)對損傷的一種保護(hù)性反應(yīng)，對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及生理功能有著非常重要的作用[6-9]。推測自噬可能是防止血管內(nèi)皮缺血損傷的一種潛在機(jī)制，有可能成為心血管疾病治療的新靶點(diǎn)和新策略。Xie等[10]用AGEs修飾的牛血清白蛋白AGEs-BSA培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，發(fā)現(xiàn)AGEs-BSA 在作用早期可以提高 HUVECs 的自噬水平而抵抗損傷。Han等[11]發(fā)現(xiàn)預(yù)孵育姜黃素能誘導(dǎo)HUVECs自噬，顯著增加過氧化氫處理HUVECs的生存能力。張艷林等[12]用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激內(nèi)皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)ox-LDL可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，同時乳酸脫氫酶(LDH)和ET-1的分泌增加說明細(xì)胞受到損傷，而這種損傷可被自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素所降低，被自噬抑制劑3-MA所增強(qiáng)，提示自噬在ox-LDL導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中起保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血CMECs能夠發(fā)生自噬，但是細(xì)胞凋亡增加，內(nèi)皮功能受到損傷，雷帕霉素干預(yù)后的缺血CMECs，電鏡下觀察到自噬小體數(shù)目增多，細(xì)胞凋亡減少，內(nèi)皮功能得到改善，缺血CMECs的自噬流是受到抑制的，整個自噬過程是存在障礙的，這種障礙很有可能發(fā)生在自噬溶酶體的環(huán)節(jié)。

根據(jù)冠心病“本虛標(biāo)實(shí)”的基本病機(jī)，結(jié)合戴國華教授提出的冠心病“風(fēng)病”學(xué)說，認(rèn)為心腎陽虛、氣血失調(diào)是冠心病發(fā)病的基礎(chǔ)，風(fēng)邪是冠心病重要的致病因素，脈滯風(fēng)阻是冠心病發(fā)作的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。確立了祛風(fēng)活血通絡(luò)、補(bǔ)腎益氣生脈的治療方法，研制成中藥祛風(fēng)生脈顆粒，從風(fēng)邪論治冠心病有著豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，且對安全性的顧慮較少。用祛風(fēng)生脈顆粒大鼠含藥血清，與缺血CMECs共孵育，電鏡下觀察到自噬小體數(shù)目明顯增多，同時觀察到較多的自噬溶酶體，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高，細(xì)胞總凋亡率明顯減少，ET-1水平降低(P<0.01)，提示祛風(fēng)生脈顆粒干預(yù)后不僅促進(jìn)了自噬小體的生成，而且促進(jìn)了整個自噬流，包括自噬溶酶體的生成，達(dá)到減少細(xì)胞凋亡，改善內(nèi)皮功能的干預(yù)效應(yīng)。至于祛風(fēng)生脈顆粒調(diào)控自噬的分子機(jī)制，尚需要進(jìn)一步深入研究。