張涵妮，祝文浩，王慧茹，郭云良，葛科立*，王亞男*

(1.青島大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 中西醫(yī)結(jié)合中心，山東 青島 266000；2. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，安徽 合肥 230000)

胃癌(Gastric Cancer)是臨床常見(jiàn)消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，而死亡率居惡性腫瘤第3位[1]。在中國(guó)，2015年胃癌的發(fā)病率為15.8%，死亡率為17.6%，在所有癌癥中排名第2位[2]。目前，胃癌的現(xiàn)代治療以手術(shù)結(jié)合放、化療及靶向治療為主，存在治療不徹底、毒副作用顯著、復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移等問(wèn)題[3]，尋找更為安全有效的療法是亟待解決的難題。

中醫(yī)藥在胃癌防治方面具有減毒增敏、穩(wěn)定瘤體、提高中遠(yuǎn)生存期等優(yōu)勢(shì)[4]。吳茱萸是中醫(yī)治療脾胃病的常用中藥，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉的功效，其主要成分為吳茱萸堿(Evodiamine,EVO)，具有抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[5]。研究表明，吳茱萸堿對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞、肝癌Huh7細(xì)胞等具有增殖抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用[6-7]，但其具體的抗腫瘤分子機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)以人胃癌BGC-823細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討吳茱萸堿對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與儀器

1.1 人胃癌細(xì)胞及吳茱萸堿

人胃癌BGC-823細(xì)胞株購(gòu)自國(guó)家細(xì)胞資源中心，由本實(shí)驗(yàn)室冷凍保存。吳茱萸堿(EVO)購(gòu)自北京生物制品研究所，批號(hào)：0802-9702，溶解于含0.1% DMSO的PBS溶液配制成質(zhì)量濃度為50 μM，-20 ℃避光貯存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與器材

DME/F-12培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(FBS)(BI)；PBS(HyClone)；0.25%胰蛋白酶(Gbico)；二甲基亞砜(DMSO)(Solarbio)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué))；PI試劑盒(beyotime)；AnnexinV/APC+7AAD細(xì)胞凋亡試劑盒(Biolegend)；一抗：Cdc25c Rabbit、Caspase-3 Rabbit、Caspase-8 Mouse、Caspase-9 Rabbit 、PARP-1 Rabbit、GAPDH(CST)和p53(Proteintech)；二抗：山羊抗兔、山羊抗小鼠(中杉金橋)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀，Heracell 150i CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；Primovert倒置相差顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；FACS CantoTM流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；電泳/轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad 公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

BGC-823細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DME/F-12培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2條件下的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法檢測(cè)BGC-823細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶-EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液，以每孔2×103個(gè)接種于96孔板?？瞻捉M為含10%胎牛血清的DME/F-12培養(yǎng)基，但沒(méi)有細(xì)胞。對(duì)照組加DME/F-12培養(yǎng)基，不加藥。實(shí)驗(yàn)組的吳茱萸堿(EVO)終濃度分別為1 μM、2.5 μM、5 μM、7.5 μM、10 μM，每組5個(gè)復(fù)孔，分為24 h、48 h、72 h 3個(gè)時(shí)間觀(guān)測(cè)點(diǎn)。依照CCK-8試劑盒步驟檢測(cè)各觀(guān)測(cè)點(diǎn)每組細(xì)胞的抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=(細(xì)胞對(duì)照組A450-實(shí)驗(yàn)組A450/細(xì)胞對(duì)照組A450-空白組A450)×100%。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/mL，以每孔2 mL細(xì)胞懸液接種于6孔板，分對(duì)照組和EVO干預(yù)組，每組3復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，棄舊培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入10 μM EVO培養(yǎng)液2 mL，置于培養(yǎng)箱中，于24 h后鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EVO對(duì)BGC-823細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響

將10 μM EVO干預(yù)組和對(duì)照組的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心、棄上清，加入70%預(yù)冷乙醇于4 ℃下培養(yǎng)過(guò)夜。細(xì)胞周期：PBS洗滌，離心，加入RNase(10 μg/mL)，孵育15 min，加入10 μg/mL碘化丙啶(PI)，避光30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，并繪制相應(yīng)細(xì)胞周期曲線(xiàn)-直方圖。細(xì)胞凋亡：PBS洗滌，以(2.5～10)×106個(gè)/mL細(xì)胞濃度重懸于Annexin V Binding Buffer，每組取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin V及5 μL 7AAD，室溫避光孵育15min，每管加入400 μL Annexin V Binding Buffer，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，BD軟件分析凋亡結(jié)果，繪制統(tǒng)計(jì)圖表。

2.5 Western-blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)

提取各組樣品蛋白10 mg，用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜浸入5%BSA封閉液，室溫封閉1 h，然后放入一抗(使用上述各蛋白抗體，1∶1 000)4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，用TBST配制羊抗兔二抗稀釋液(1∶2 000)室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次。最后加100 mL顯影液混勻，UVP凝膠成像分析系統(tǒng)(Biospectrum 810 Imaging System, USA)曝光顯影。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 EVO對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖抑制作用

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度(1、2.5、5、7.5、10 μM)的EVO作用于BGC-823細(xì)胞24、48、72 h后，能明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖，隨著EVO濃度的增加，細(xì)胞增殖活性呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.01)，呈時(shí)間和劑量依賴(lài)效應(yīng)，且以10 μM EVO對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用最為明顯(P<0.001)，見(jiàn)圖1。經(jīng)Graph-Pad Prism 7.0軟件擬合計(jì)算24 h的IC50為9.73 μM，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用10 μM為工作濃度。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EVO呈時(shí)間-劑量依賴(lài)性抑制BGC-823細(xì)胞的增殖活力。

圖1 不同濃度及不同作用時(shí)間EVO對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖的作用

3.2 EVO處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)相比，EVO組可見(jiàn)懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞貼壁性差，并且細(xì)胞胞體縮小、變圓、皺縮，彼此分開(kāi)未形成集落，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量顆粒樣物質(zhì)，培養(yǎng)液中有較多的細(xì)胞碎片，細(xì)胞活力顯著降低。見(jiàn)圖2。

圖2 10 μM EVO作用24 h后BGC-823細(xì)胞形態(tài)的變化(比例尺：100 μm)

3.3 EVO對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞周期的影響

采用PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EVO作用于胃癌細(xì)胞24 h后對(duì)細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，EVO組G0/G1期細(xì)胞比率由42.70%下降至8.36%，而G2/M期細(xì)胞比率則由22.50%增長(zhǎng)至54.90%(P<0.001)，見(jiàn)圖3、表1。由此可見(jiàn)，EVO能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。

圖3 10 μM EVO作用24 h后對(duì)BGC-823細(xì)胞周期的影響

組別G0/G1期S期G2/M期 對(duì)照組42.62±0.28???17.65±3.1123.37±1.03 EVO處理組8.57±0.4019.30±4.3454.13±1.34???t10.6812.12111.552P0.00030.1010.0002

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.4 EVO對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin V/APC+7AAD雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌BGC-823細(xì)胞經(jīng)10 μM EVO 處理24 h后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率相比， EVO組細(xì)胞凋亡率顯著增長(zhǎng)，細(xì)胞總凋亡率為(16.50±0.62)%，且以早期凋亡為主(P<0.001)，見(jiàn)圖4、表2。表明EVO可誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡。

圖4 10 μM EVO作用24 h后對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的影響

組別早期凋亡率中晚期凋亡率總細(xì)胞凋亡率細(xì)胞死亡率對(duì)照組EVO處理組2.23±0.507.53±0.71??7.77±0.318.97±0.60?10.00±0.5316.50±0.62???4.37±0.454.63±0.11t-5.209-2.941-10.4230.378P0.0060.0420.00010.725

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.5 Western-blot檢測(cè)EVO對(duì)BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)EVO作用于BGC-823細(xì)胞周期阻滯實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，筆者發(fā)現(xiàn)EVO抑制胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制可能是EVO將癌細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，特別是早期凋亡而抑制胃癌細(xì)胞增殖。基于此，筆者采用Western-blot檢測(cè)相關(guān)蛋白在10 μM EVO作用于BGC-823細(xì)胞不同時(shí)間段(0、3、6、9、12、24 h)后的表達(dá)情況，結(jié)果表明Cdc25C蛋白水平呈下降趨勢(shì)，而p53、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9和cleaved PARP-1蛋白水平呈上升趨勢(shì)，見(jiàn)圖5。由此可見(jiàn)，EVO可能通過(guò)上調(diào)p53、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9和cleaved PARP-1蛋白水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并呈時(shí)間依賴(lài)性。

4 討論

胃癌作為我國(guó)消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，臨床治療也面臨諸多挑戰(zhàn)。現(xiàn)今，中醫(yī)藥在腫瘤中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。其中，從蕓香科植物吳茱萸、石虎或疏毛吳茱萸的干燥成熟果實(shí)中提取的EVO已在乳腺癌[8]、結(jié)腸癌[9]、肺癌[10]和骨肉瘤[11]等多種腫瘤的治療中顯現(xiàn)出良好的抗癌活性。然而，EVO對(duì)胃癌細(xì)胞相關(guān)分子作用機(jī)制的研究尚需完善。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量的EVO處理人胃癌BGC-823細(xì)胞株24 h、48 h、72 h后，CCK-8法檢測(cè)顯示其能顯著抑制BGC-823細(xì)胞增殖(P<0.01)，并呈時(shí)間-劑量依賴(lài)性。細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)異常是腫瘤細(xì)胞惡性增殖的核心環(huán)節(jié)，研究表明，細(xì)胞的增殖、分化、衰老和凋亡均呈細(xì)胞周期依賴(lài)性[12]，因此，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程是阻止腫瘤細(xì)胞異常增殖的有效途徑之一。Yang Fan等[13]發(fā)現(xiàn)EVO能顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，將細(xì)胞阻滯于G2/M期，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。也有學(xué)者[14]研究表明低劑量EVO可將纖維肉瘤L929細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，而高劑量則引起G0/G1期阻滯。本實(shí)驗(yàn)使用流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，10 μM EVO作用于BGC-823細(xì)胞24 h后，G2/M期細(xì)胞比率增長(zhǎng)至54.90%(P<0.001)，細(xì)胞凋亡率也顯著增長(zhǎng)，且以早期凋亡為主(P<0.001)。由此可知，EVO抑制BGC-823細(xì)胞增殖亦與其誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期阻滯和增加細(xì)胞凋亡率有關(guān)。

真核細(xì)胞順利通過(guò)G1/S期檢查點(diǎn)后，周期蛋白CyclinB1開(kāi)始累積并與Cdc2(CDK1)形成復(fù)合物推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入M期[15]，其中周期蛋白Cdc25C參與Cdc2的活化至關(guān)重要，其表達(dá)下調(diào)能抑制Cdc2/CyclinB1復(fù)合體的活化，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期[16]。同時(shí)，Cdc25C的表達(dá)受細(xì)胞周期抑制蛋白p53的調(diào)控，p53能與Cdc25C啟動(dòng)子結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄，維持細(xì)胞周期平穩(wěn)運(yùn)行[17]。Chien等[18]使用不同濃度的EVO干預(yù)人結(jié)腸癌COLO205、HT-29細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能通過(guò)抑制JNK信號(hào)的活化下調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cdc25C表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期。也有研究[19]表明二烯丙基二硫化物(DADS)能通過(guò)激活p53/p21信號(hào)通路下調(diào)細(xì)胞周期蛋白CyclinB1、Cdc2、p-Cdc2和Cdc25C的表達(dá)，誘導(dǎo)食管鱗狀癌ECA109細(xì)胞阻滯于G2/M期。與之相似，本實(shí)驗(yàn)研究也表明EVO作用于BGC-823細(xì)胞24 h后，p53蛋白表達(dá)上調(diào)，Cdc25C蛋白表達(dá)下調(diào)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞受基因調(diào)控的自主性、程序性死亡過(guò)程，其中caspase家族蛋白和p53蛋白等在其信號(hào)調(diào)控中扮演重要角色[20-21]。研究表明，線(xiàn)粒體膜電位變化、死亡受體途徑激活等均能引起caspases信號(hào)級(jí)聯(lián)活化，通過(guò)相互激活又可自我激活模式使效應(yīng)放大，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22]。caspase-3作為執(zhí)行凋亡最主要的效應(yīng)因子，通過(guò)剪切死亡底物PARP-1，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。Fu Z等[24]采用大戟提取物通過(guò)caspases信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活，促使細(xì)胞凋亡，抑制了胃癌細(xì)胞增殖。用異黃酮類(lèi)物質(zhì)作用于胃癌細(xì)胞后，啟動(dòng)TRAIL-FADD-caspases-8凋亡途徑，增加caspases-3和PARP-1的剪切，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)EVO作用于BGC-823細(xì)胞后，上調(diào)了cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9和cleaved PARP-1的表達(dá)，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。

圖5 10 μM EVO作用0、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h后對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

綜上所述，EVO可能通過(guò)上調(diào)p53表達(dá)和下調(diào)Cdc25C表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G2/M期阻滯，并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與上調(diào)cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9和cleaved PARP-1表達(dá)相關(guān)，這也是EVO應(yīng)用于胃癌治療的新的潛在機(jī)制，為后續(xù)研究提供了參考。