張春利，蔡徐山，宦 宇，齊結(jié)華，王曉青，王東江

(上海市嘉定區(qū)婦幼保健院檢驗科，上海 201821)

去整合素金屬蛋白酶17(ADAM17)是去整合素金屬蛋白酶家族(ADAMs)的重要成員之一。ADAMs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有金屬蛋白酶活性的細胞膜表面糖蛋白，迄今為止已發(fā)現(xiàn)有40多個成員，這些成員大多含有金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域，它們參與了多種生物學功能，包括生育、黏附、遷移、炎癥、蛋白水解、細胞傳導以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等[1]，目前研究較多的是ADAM10、ADAM17。ADAM17的前體結(jié)構(gòu)域能與鋅催化位點相結(jié)合，只有當其前體結(jié)構(gòu)域被蛋白酶水解后，ADAM17才具有酶催化活性，從而參與多種蛋白的水解[2]。ADAM17的一個重要功能是能剪切細胞膜上沒有活性的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，并與相應受體結(jié)合，激活下游信號通路，參與一系列生物學過程，所以ADAM17又稱為腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)換酶(TACE)[3]。已有研究表明，ADAM17在多種腫瘤中表達水平明顯升高，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的促進作用，因此有必要對ADAM17進行深入的研究。

RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA所誘導的轉(zhuǎn)錄后基因表達沉默現(xiàn)象，通過RNAi途徑，特異地降解其目的基因，從而抑制該目的基因的表達[4]。RNAi技術(shù)對靶基因的沉默具有高效、特異、設(shè)計簡便、操作方便等特點。近年來在基因功能研究及相應的后續(xù)基因治療中已有較廣泛的應用。本研究旨在構(gòu)建能夠有效靶向人源ADAM17基因的shRNA表達質(zhì)粒，從而為后續(xù)研究做準備。

1 材料與方法

1.1材料來源 人胰腺癌細胞株(PANC1)、感受態(tài)細胞stbl3、pLKO.1-puro載體由江蘇大學醫(yī)學院提供。高糖DMEM溶液購自Wisent公司；PBS溶液購自Hyclone公司；胰蛋白酶粉購自生興公司；胎牛血清FBS購自Gibco公司；DMSO購自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和AgeⅠ購于NEB公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、預染蛋白質(zhì)Marker、DNA相對分子質(zhì)量Marker DL2000、DL15 000購自Thermo公司；2×Green PCR Mix、2×SYBR Green Mix購自TransGen公司；PVDF膜購自BIO-RAD公司；兔抗人ADAM17抗體購自Cell Signaling公司；鼠抗人GAPDH抗體購自Santa Cruz公司；羊抗兔、羊抗鼠二抗購于Santa Cruz公司；dsDNA oligos由生工(上海)股份有限公司合成；30%丙烯酰胺購于蘇州圣康科技公司；T4連接酶購自takara；Trizol、柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒購于生工(上海)股份有限公司；DNA測序由生工(上海)股份有限公司完成。

1.2方法

1.2.1ADAM17干擾表達載體的構(gòu)建 根據(jù)Sigma公司提供的ADAM17干擾序列5′-CCG GCC CAT GAA GAA CAC GTG TAA ACT CGA GTT TAC ACG TGT TCT TCA TGG GTT TTT G-3′，5′-AAT TCA AAA ACC CAT GAA GAA CAC GTG TAA ACT CGA GTT TAC ACG TGT TCT TCA TGG G-3′，以干擾與人的任何基因序列均無同源關(guān)系的eGFP為陰性對照，序列為5′- CCG GTA CAA CAG CCA CAA CGT CTA TCT CGA GAT AGA CGT TGT GGC TGT TGT ATT TTT-3′，5′-AAT TAA AAA TAC AAC AGC CAC AAC GTC TAT CTC GAG ATA GAC GTT GTG GCT GTT GTA-3′，送至生工(上海)股份有限公司合成。將ADAM17基因shRNA的正鏈、反鏈退火形成雙鏈DNA。該DNA片段含有限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ所能識別的黏性末端；將該退火雙鏈DNA與pLKO.1載體經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后膠回收的產(chǎn)物在T4連接酶的作用下進行連接，將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞Stbl3中，并涂于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)板上進行篩選培養(yǎng)。挑取單克隆菌落進行擴增，用菌液PCR鑒定，并提取質(zhì)粒送往生工基因測序鑒定。

1.2.2轉(zhuǎn)染PANC1細胞 將PANC1細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，并接種到6孔板中。每孔加入約2 μL無抗生素培養(yǎng)基，培養(yǎng)細胞至融合度約為70%～80%時，參照Lipofectamine 2000說明書的方法將ADAM17 shRNA及陰性對照組eGFP shRNA分別轉(zhuǎn)染至PANC1 細胞中，5～6 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3q-PCR檢測重組載體干擾效果 將上述轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48 h，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再根據(jù)TransGen qPCR(SYBR)試劑盒的說明書來擴增。ADAM17上游引物序列:5′-AGA GCT GAC CCA GAT CCC AT-3′，下游引物序列:5′-TAC TCT CTT CCC CTC TGC CC-3′。GAPDH上游引物序列:5′-TGG GGA AGG TGA AGG TCG G-3′，下游引物序列:5′-CTG GAA GAT GGT GAT GGG A-3′。以GAPDH為內(nèi)參，以2-△△Ct法分別計算并比較干擾組和對照組ADAM17 mRNA的表達水平。

1.2.4Western blot檢測重組載體干擾效果 收集轉(zhuǎn)染48 h后的干擾組和對照組PANC1細胞，用細胞裂解液提取各組總蛋白，進行10% SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再用抗人ADAM17的兔源抗體(1∶1 000，3% BSA) 4 ℃孵育過夜，以β-tubulin為內(nèi)參。次日，TBST洗膜5 min，并重復3次，加入HRP(辣根過氧化物酶)標記的山羊抗兔IgG(二抗，1∶5 000)，室溫反應1 h；TBST洗膜后，用ECL試劑進行顯影并檢測。

1.2.5CCK-8法檢測所構(gòu)建質(zhì)粒對PANC1細胞增殖能力的影響 將轉(zhuǎn)染12 h后的各組細胞以1×103/孔的濃度接種于96孔板，并設(shè)置空白對照組(無細胞)，分別于24、48、72 h加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育2 h后，用酶標儀490 nm波長測量各孔的吸光度。重復實驗3次后取平均值，以時間為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1靶向ADAM17基因干擾表達載體的構(gòu)建 菌液經(jīng)PCR擴增后，所得產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，產(chǎn)物1、3、4、5、6均有目的條帶(圖1)，將這5個菌液培養(yǎng)擴增并提取質(zhì)粒后測序，測序結(jié)果完全正確(圖2)。

注：M為DNA 2 000 bp marker;1 、2、3、4、5、6為不同菌落

圖1菌液PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖2 重組質(zhì)粒pLKO.1-puro ADAM17 shRNA的測序圖譜

2.2熒光定量 PCR 檢測 pLKO.1-puro ADAM17 shRNA干擾效果 為了明確 ADAM17 在轉(zhuǎn)染后被干擾的效果，本研究用qPCR檢測轉(zhuǎn)染后不同組的mRNA 表達水平。如圖 3 所示，與對照組相比較，轉(zhuǎn)染ADAM17干擾載體的PANC1細胞，ADAM17 mRNA表達水平下調(diào)了65%以上，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：*P<0.05，與sh-eGFP組比較

圖3q-PCR評估shRNA干擾效果

2.3Western Blot檢測 pLKO.1-puro ADAM17 shRNA干擾效果 Western Blot 檢測結(jié)果顯示(圖4)，與對照組相比較，轉(zhuǎn)染ADAM17干擾載體的PANC1細胞，ADAM17蛋白的表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這說明所構(gòu)建質(zhì)粒對ADAM17蛋白的表達有明顯的抑制作用，因此可用于后續(xù)實驗。

2.4CCK-8實驗檢測pLKO.1-puro ADAM17 shRNA對PANC1細胞增殖的影響 為分析pLKO.1-puro ADAM17 shRNA對 PANC1細胞增殖速率的影響，分別在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的24、48、72 h檢測96孔板中各組細胞吸光度，分析其增殖情況。與對照組相比，干擾組細胞增殖速率明顯降低(圖5)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：*P<0.05,與sh-eGFP組比較

圖4WesternBlot評估shRNA干擾效果

注：*P<0.05，與sh-eGFP組比較

圖5pLKO.1-puroADAM17shRNA對PANC1

細胞增殖的影響

3 討 論

去整合素-金屬蛋白酶家族(ADAMs)是一類鋅依賴性的跨膜糖蛋白，它們有5個基本功能：蛋白水解、生物活性因子釋放、附著、融合和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，因此，它們在生物發(fā)育和生存中的作用是復雜的、多方面的[5-6]。其中，ADAM17和腫瘤的關(guān)系已成為研究的熱點，越來越多的研究表明，ADAM17在人類多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達，而在正常細胞中表達很少，具有一定的腫瘤細胞特異度，并促進腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲。Oh ST等通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，ADAM17在皮膚鱗狀細胞癌中的表達水平升高，且隨分化程度越來越低，ADAM17的表達水平越來越高[7]；在肝癌中，ADAM17通過EGFR/PI3K/Akt通路介導了化療抵抗[8]；CHEN等[9]的研究結(jié)果表明，miR-338-3p在胃癌中的表達水平降低，而過表達miR-338-3p后，胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力均被抑制，但ADAM17可以逆轉(zhuǎn)miR-338-3p的這些作用，促進胃癌細胞增殖、遷移、侵襲；表皮生長因子受體(EGFR)是原癌基因c-erbB1編碼的糖蛋白，屬于Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體，在許多人類實體腫瘤中有表達或過度表達，與腫瘤的形成和發(fā)展有關(guān)，而ADAM17可水解釋放EGFR的多種配體[10-11]，HUANG等[12]的研究表明，ADAM17通過活化EGFR的多種配體，促進了頭頸鱗狀細胞癌的增殖、遷移；在腎癌細胞中，MicroRNA-145的降低使ADAM17表達水平升高，從而導致了腎癌的惡性進展[13]。綜上所述，ADAM17在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有一定的促進作用，有可能成為預測惡性腫瘤是否轉(zhuǎn)移及預后的重要標志物。

RNAi是一種抑制基因表達的技術(shù)，通過小干擾RNA(siRNA)，降解同源mRNA，從而沉默特定基因表達[14-15]。其中，siRNA可通過體外轉(zhuǎn)錄或用化學方法合成，但化學合成siRNA成本較高、不能持續(xù)抑制基因表達、且易于污染，體外轉(zhuǎn)錄法得到的siRNA量有限，而shRNA可以解決這些問題，shRNA是在編碼siRNA正、反鏈之間添加一段不互補的堿基序列，使RNA折疊成發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成loop環(huán)，與相應的載體連接構(gòu)成質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)染進入細胞，經(jīng)胞質(zhì)中的核酸酶切割成siRNA，siRNA解鏈后再與RNA誘導的沉默復合物(RISC)相結(jié)合，識別與其序列互補配對的同源mRNA，降解mRNA從而沉默目的基因[16]。該方法無需直接操作RNA，且作用效果更好，有更加廣泛的應用前景。

本研究成功構(gòu)建了人ADAM17基因干擾表達載體，在菌液PCR結(jié)果中，產(chǎn)物2沒有目的條帶，這可能是由于操作過程中不夠嚴謹而出現(xiàn)雜菌污染，但其余5個產(chǎn)物均在相應位置有條帶，且提取質(zhì)粒后，測序結(jié)果完全正確。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胰腺癌細胞PANC1，有效地下調(diào)了PANC1細胞中ADAM17 mRNA和蛋白水平的表達，同時，轉(zhuǎn)染后細胞的增殖能力明顯被抑制。

4 結(jié) 論

本研究將靶向ADAM17的shRNA連接到了pLKO.1-puro載體中，測序成功后，瞬時轉(zhuǎn)染至胰腺癌細胞PANC1，顯著降低了實驗組細胞中ADAM17的mRNA和蛋白表達水平，說明該質(zhì)粒構(gòu)建成功；實驗組細胞增殖速率顯著降低，說明該質(zhì)粒可在體外培養(yǎng)的腫瘤細胞中發(fā)揮作用，為進一步研究ADAM17在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及機制奠定了基礎(chǔ)。