郭薇霞,唐 健,何建萍,羅勝軍,黃 鎧,林克勤,褚嘉祐,楊昭慶△

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所遺傳室,云南昆明 650118;2.昆明市婦幼保健院遺傳室，云南昆明 650031)

異常血紅蛋白是由于珠蛋白基因突變導(dǎo)致珠蛋白分子結(jié)構(gòu)和功能異常的一類血紅蛋白，當(dāng)產(chǎn)生臨床表現(xiàn)時(shí)稱為異常血紅蛋白病[1]。異常血紅蛋白的種類和分布頻率存在地域和人種差異[2]，根據(jù)人類血紅蛋白變異體數(shù)據(jù)庫HbVar(http://globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html)結(jié)果顯示，目前全世界報(bào)道的發(fā)生在α珠蛋白肽鏈上的異常血紅蛋白超過490種，我國報(bào)道的有38種。大多數(shù)異常血紅蛋白是由于珠蛋白鏈上單個(gè)堿基替換引起的，不產(chǎn)生臨床癥狀，因此需要借助血紅蛋白電泳和基因檢測才能確診[3]。本研究通過對血紅蛋白電泳結(jié)果異常的1例樣本進(jìn)行了基因診斷，檢出了1例α珠蛋白基因新突變型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 先證者：女，26歲,就診于云南省昆明市婦幼保健院。由于無法聯(lián)系到這患者及其家屬，未采集到家系其他成員血樣。

1.2方法

1.2.1血液學(xué)檢查 取靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸鉀(EDTA-K2)抗凝后，采用血細(xì)胞分析儀日本sysmex XT-2000i檢測紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量(Hb)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)和平均血紅蛋白含量(MCH)等血常規(guī)指標(biāo)。采用歐洲helena V8全自動毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行血紅蛋白電泳檢測。

1.2.2常見地貧突變基因檢測 采用PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測23種中國人常見的地中海貧血基因型(SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αQSα、αWSα、41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、IVS-I-1M、IVS-I-5M、27/28M、43M、-29M、-30M、31M、-32M、14-15M、IntM和CAPM)。所用試劑為亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供的地中海貧血基因檢測試劑盒。

1.2.3α和β珠蛋白基因片段擴(kuò)增 采用Axygen公司的AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作提取全血DNA。根據(jù)NCBI中α、β珠蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增包括轉(zhuǎn)錄啟動子序列及3個(gè)外顯子在內(nèi)α、β珠蛋白基因序列。引物序列如表1所示，由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增采用大連寶生物公司的TaKaRa LA Taq酶，儀器使用美國ABI公司的9700 PCR擴(kuò)增儀。β基因、α1基因、α2基因PCR擴(kuò)增體系均為30 μL:每一反應(yīng)體系含2×GC Mix Buffer 15 μL、上下游引物各0.3 μL、LA Taq 0.2 μL、H2O 11.2 μL、DNA模板含量約100 ng。反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸20 min。

1.2.4α和β珠蛋白基因片段測序 純化PCR產(chǎn)物后，送昆明碩擎生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，見表1。

表1 α、β珠蛋白基因擴(kuò)增引物

續(xù)表1 α、β珠蛋白基因擴(kuò)增引物

2 結(jié) 果

2.1血常規(guī)結(jié)果 先證者血常規(guī)結(jié)果為：RBC 4.61×1012、Hb 143 g/L、MCV 92.4 fL、MCH 31 pg，為正細(xì)胞正色素，無明顯異常。

2.2血紅蛋白毛細(xì)管電泳結(jié)果 先證者HbA占總血紅蛋白含量為76.35%、血紅蛋白A2(HbA2)為1.42%、血紅蛋白(HbF)含量異常升高，達(dá)到了18.56%，產(chǎn)生一個(gè)未命名的未知條帶，含量為3.10%，如圖1所示。

2.3基因型檢測結(jié)果 先證者檢出HbA2基因第27位密碼子GAG>CAG，Glu>Gln雜合突變，采用人類基因組變異協(xié)會(HGVS)命名規(guī)則命名為HBA2:c.82G>C(圖2)，未檢出α、β地貧基因突變。

注：產(chǎn)生與HbF未完全分離的未知異常條帶

圖1HbMile血紅蛋白電泳圖

注：α珠蛋白基因第27位密碼子GAG>CAG雜合突變，箭頭表示突變

圖2HbMile測序圖

3 討 論

我國異常血紅蛋白的發(fā)生率和分布存在明顯遺傳多態(tài)性，2003年全國各地區(qū)異常血紅蛋白發(fā)生率普查結(jié)果顯示云南異常血紅蛋白發(fā)生率最高，達(dá)到了5.93%[4]。目前云南報(bào)道較多、最常見的異常血紅蛋白為HbE[5]，也有一些罕見異常血紅蛋白如Hb Rush的報(bào)道[6]。而本研究此次檢出的Hb Mile為世界范圍內(nèi)首次報(bào)道。

該突變攜帶者是26歲女性在進(jìn)行地中海貧血產(chǎn)前篩查時(shí)，常見地貧基因檢測結(jié)果都為陰性，但是血紅蛋白電泳檢查結(jié)果卻較為罕見與復(fù)雜。經(jīng)過復(fù)查后發(fā)現(xiàn)該突變產(chǎn)生的未知異常血紅蛋白條帶與F帶利用等點(diǎn)聚焦毛細(xì)管電泳技術(shù)不能完全分開，在電泳結(jié)果圖上表現(xiàn)為F帶與異常條帶波谷融合，此時(shí)檢測到的F帶含量為18.56%，是HbF和部分異常條帶含量的總和。為了進(jìn)一步明確異常血紅蛋白條帶產(chǎn)生的原因所以進(jìn)行了血紅蛋白基因測序檢查，最終檢出α珠蛋白基因HBA2第27位密碼子GAG>CAG雜合突變。

本研究檢出的Hb Mile是由于α2珠蛋白基因第27位密碼子GAG>CAG雜合突變(HGVS命名HBA2:c.82G>C),導(dǎo)致該位置上的谷氨酸(Glu)被替換為谷氨酰胺(Gln)，該突變先前未見相關(guān)報(bào)道，這是首次報(bào)道，并以先證者的籍貫地云南彌勒命名。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析顯示該突變位于α珠蛋白的保守區(qū)域，與β珠蛋白交聯(lián)的位點(diǎn)[7]。盡管該G>C突變從未報(bào)道過，但是該位置上報(bào)道過其他突變類型Hb Shuangfeng (HBA2 or HBA1:c.82G>A)，這一突變在一中國漢族家系中發(fā)現(xiàn)，它是第27位密碼子谷氨酸被賴氨酸替代，產(chǎn)生含量為13%的不穩(wěn)定異常血紅蛋白，雜合子個(gè)體即產(chǎn)生了溶血性貧血的臨床癥狀[8]。提示這一位點(diǎn)在維持血紅蛋白穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用，但是本研究中Hb Mile先證者血液學(xué)參數(shù)正常，推測可能是由于替換的氨基酸Gln與原來的Glu性質(zhì)相似，所以突變后對血紅蛋白的功能影響較小，攜帶者不產(chǎn)生臨床表現(xiàn)。

由于大多數(shù)異常血紅蛋白不產(chǎn)生臨床表現(xiàn)，所以只通過血常規(guī)指標(biāo)難以有效篩查血紅蛋白病，而毛細(xì)管電泳具有更高的分辨率和準(zhǔn)確性，目前已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室診斷血紅蛋白病的重要手段之一[9]。但是由于異常血紅蛋白具有異質(zhì)性，同一電泳區(qū)帶可能是由多種突變造成[10]，而本研究中則出現(xiàn)了利用毛細(xì)管電泳技術(shù)也不能將異常條帶與F帶完全分離的罕見狀況。若能重新采集患者及家系成員血樣，可以考慮使用分辨率較高的高效液相色譜法對異常血紅蛋白含量進(jìn)行檢測。因此將血紅蛋白電泳和基因診斷相結(jié)合，才有利于檢出更多的異常血紅蛋白突變型，基因檢測結(jié)果能指導(dǎo)電泳結(jié)果進(jìn)行正確解讀。

4 結(jié) 論

本研究首次報(bào)道了α珠蛋白基因突變型Hb Mile(HBA2:c.82G>C，CD27:Glu>Gln)，豐富了我國和人類血紅蛋白突變譜。通過對表型進(jìn)行初步分析，該突變不產(chǎn)生明顯臨床癥狀，但是由于云南是地中海貧血和異常血紅蛋白病高發(fā)區(qū)，異常血紅蛋白突變有較大概率產(chǎn)生復(fù)合雜合子，因此其臨床危害性和人群發(fā)生率有待于繼續(xù)研究。