山媛，崔小麗，蔣鋒，梁導(dǎo)艷，孫晶瑩

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）是臨床最常見的腦血管疾病，約占腦血管疾病患者總數(shù)的70%。據(jù)統(tǒng)計，我國每年有150～200萬例新發(fā)卒中患者，這給患者及其家屬造成嚴(yán)重的經(jīng)濟及心理負擔(dān)［1］。AIS發(fā)病原因復(fù)雜，存在個體差異，且與環(huán)境、遺傳等多種因素有關(guān)。血小板膜糖蛋白（platelet glycoprotein，GP）Ⅱb/Ⅲa受體與纖維蛋白原有效結(jié)合是血小板聚集、血栓形成的最后通路，且在血栓形成過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。PAC-1為GPⅡb/Ⅲa纖維蛋白原受體，是目前公認(rèn)的可反映早期血小板活化程度的特異性標(biāo)志物。近年來，從分子生物學(xué)角度研究GP基因多態(tài)性與AIS的關(guān)系并探討腦卒中的發(fā)病機制已成為該領(lǐng)域的研究熱點。本研究旨在分析GPⅡb、Ⅲa基因多態(tài)性與AIS的關(guān)系，以初步探討AIS的發(fā)病機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年10月—2018年11月陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科收治的AIS患者110例作為病例組，均符合《各類腦血管疾病診斷要點》［2］中AIS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)顱腦磁共振成像（MRI）檢查確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）發(fā)病至入院時間≤7 d；（2）首次發(fā)病且未服用抗栓、抗凝藥物（如阿司匹林、氯吡格雷、雙嘧達莫、華法林等）或既往腦梗死近2周停用抗栓、抗凝藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并出血性腦血管疾病、短暫性腦缺血發(fā)作（TIA）、顱內(nèi)占位性病變、顱內(nèi)感染者；（2）伴有嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；（3）合并血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重自身免疫系統(tǒng)疾病者；（4）臨床資料不完整；（5）患者或其家屬依從性差、不能完全配合研究者。另選取同期在陜西省人民醫(yī)院門診體檢中心的體檢健康者90例作為對照組。本研究經(jīng)陜西省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有受試者知情并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo) 比較兩組受試者一般資料、實驗室檢查指標(biāo)及GPⅡb、Ⅲa基因型和等位基因分布頻率，不同GPⅡb、Ⅲa基因型患者PAC-1陽性血小板百分比。

1.2.1 一般資料 收集兩組受試者一般資料，包括性別、年齡及吸煙、飲酒情況。

1.2.2 實驗室檢查指標(biāo) 病例組患者于服用抗栓、抗凝藥物前采集肘靜脈血2 ml，對照組受試者于體檢當(dāng)天抽取肘靜脈血2 ml，均于0.5 h內(nèi)送檢。采用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體流式細胞術(shù)檢測細胞抗原表達、細胞大小及細胞內(nèi)顆粒，識別正常細胞和異常細胞，計數(shù)PAC-1陽性血小板百分比，其參考范圍為0～10%。單克隆抗體及其配套試劑均購自美國BD公司，所用儀器為Beckman Coulter FC500流式細胞儀。采用氧化酶法檢測兩組受試者總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、空腹血糖（FPG）及同型半胱氨酸（Hcy）水平，所用儀器為美國貝克曼AU 5800全自動生化分析儀。

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 抽取兩組受試者肘靜脈血400 μl，采用全血基因組DNA提取試劑盒〔天跟生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)〕提取DNA，使用紫外分光光度計測定DNA濃度，并置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。GPⅡb基因引物參照文獻［3］，GPⅢa基因引物參照文獻［4］，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，采用ABI 2720 PCR儀進行擴增反應(yīng)。GPⅡb基因上游引物序列：5'-CTCAAGGTAAGA GCTGGGTGGAAGAAAGAC-3'，下游引物序列：5'-CT CACTACGAGAACGGGATCCTGAAGCCTC-3'，擴增目的片段長度253 bp，PCR擴增反應(yīng)體系：MIX 20 μl，上、下游引物各 1 μl，DNA 2 μl，水 16 μl，共 40 μl；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變性 30 s，60.5 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 40 個循環(huán)，最后 72 ℃延伸10 min。GPⅢa基因上游引物序列：5'-GTCGCCATAGC TCTGATTGC-3'，下游引物序列：5'-GAGCCGGAGTG CAATCCTCT-3'，擴增目的片段長度239 bp，PCR擴增反應(yīng)體系：MIX 20 μl，上、下游引物各 1 μl，DNA 2 μl，水 16 μl，共 40 μl；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增反應(yīng)完成后取10 μl產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)目的片段大小。marker條帶從上往下依次是1 000、700、500、400、300、200、100，左側(cè)為GPⅢa基因擴增目的片段，右側(cè)為GPⅡb基因擴增目的片段，見圖1。1.2.4 單核苷酸多態(tài)位點（SNP）測序 將PCR擴增產(chǎn)物直接送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，分析GPⅡb、Ⅲa基因多態(tài)性，測序方法為3730鳥槍法一代測序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（x± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料分析采用χ2檢驗；采用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗基因型分布情況。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 GPⅡb、Ⅲa基因擴增目的片段Figure 1 Amplified target fragments of GP Ⅱ b，Ⅲ a genes

圖2 GPⅡb基因SNP測序結(jié)果Figure 2 SNP sequencing results of GP Ⅱ b gene

2 結(jié)果

2.1 一般資料和實驗室檢查指標(biāo) 兩組受試者男性比例、年齡、吸煙率、飲酒率及TG比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；病例組患者PAC-1陽性血小板百分比、TC、FPG、Hcy高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 SNP測序 SNP測序結(jié)果顯示，GPⅡb基因第18809位胸腺嘧啶（T）被鳥嘌呤（G）取代，使編碼第843位點的異亮氨酸（Ile）被絲氨酸（Ser）取代，形成Ile843Ser多態(tài)性，見圖2。GPⅢa基因第1565位T被胞嘧啶（C）取代，使編碼第33位點的亮氨酸（Leu）被脯氨酸（Pro）取代，形成Leu33Pro多態(tài)性，見圖3。

2.3 GPⅡb、Ⅲa基因型和等位基因分布頻率 病例組與對照組受試者基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2值分別為0.60、2.38，P值分別為0.75、0.31）。兩組受試者GPⅡb基因型和等位基因分布頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中病例組患者ab基因型、bb基因型及b等位基因分布頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。兩組受試者均未檢測出CC基因型，GPⅢa基因型和等位基因分布頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表3）。

2.4 不同GPⅡb基因型患者PAC-1陽性血小板百分比比較 aa基因型患者PAC-1陽性血小板百分比為（6.38±3.02）%，ab基因型為（7.65±4.96）%，bb基因型為（9.08±3.27）%。不同GPⅡb基因型患者PAC-1陽性血小板百分比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.297，P=0.041）；其中bb基因型患者PAC-1陽性血小板百分比高于aa基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 兩組受試者一般資料和實驗室檢查指標(biāo)比較Table 1 Comparison of general information and laboratory examination results between the two groups

2.5 不同GPⅢa基因型患者PAC-1陽性血小板百分比比較 TT基因型患者PAC-1陽性血小板百分比為（7.61±4.22）%，TC基因型為（7.33±1.23）%。不同GPⅢa基因型患者PAC-1陽性血小板百分比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.134，P=0.893）。

圖3 GPⅢa基因SNP測序結(jié)果Figure 3 SNP sequencing results of GP Ⅲ a gene

表2 兩組受試者GPⅡb基因型和等位基因分布頻率比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of genotype and allele distribution frequency of GP Ⅱ b between the two groups

表3 兩組受試者GPⅢa基因型和等位基因分布頻率比較〔n（%）〕Table 3 Comparison of genotype and allele distribution frequency of GP Ⅲ a between the two groups

3 討論

AIS具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高及致殘率高等特點，已成為嚴(yán)重威脅全球范圍內(nèi)居民健康的主要疾病之一［5-6］。既往研究表明，遺傳相關(guān)因素可能增加人群卒中易感性，成為卒中發(fā)生的重要原因之一［7-8］。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性腦卒中的重要病理基礎(chǔ)［9］，血管內(nèi)皮細胞損傷及功能障礙貫穿AS發(fā)生及發(fā)展的整個過程，暴露的膠原和組織因子促進GP與膠原結(jié)合，進而引起血小板黏附與活化，釋放二磷酸腺苷（ADP）和血栓素A2（TXA2）等活性物質(zhì)，促使GPⅡb/Ⅲa表達增加、三級結(jié)構(gòu)變化及受體結(jié)合位點暴露，最終導(dǎo)致血小板聚集及血栓形成。

既往研究表明，GP在血小板黏附、聚集和活化過程中發(fā)揮著重要作用［10］。目前已確認(rèn)的GP基因主要包括GPⅢa基因和GPⅡb基因，二者均定位于染色體17q21-q22，GPⅡb基因位于GPⅢa基因的3'端。GPⅡb基因包含30個外顯子和29個內(nèi)含子，全長約17.2 kb。GPⅢa基因包括14個外顯子和13個內(nèi)含子，基因全長約46 kb。GPⅡb和GPⅢa基因在血小板上以Ca2+依賴性二聚體形式存在，其在復(fù)合物狀態(tài)下才能很好地發(fā)揮受體功能。DNA分子上攜帶的基因信息決定蛋白質(zhì)性質(zhì)，如DNA分子上特定部位的堿基名稱、數(shù)量和順序發(fā)生改變，則其所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也會發(fā)生變化。

目前，GPⅡb基因多態(tài)性的研究報道較少，研究較為深入的是HPA3a/3b，即2622T→G突變導(dǎo)致異亮氨酸（HPA-3a）被絲氨酸（HPA-3b）取代［11］。本研究結(jié)果顯示，病例組患者ab基因型、bb基因型及b等位基因分布頻率高于對照組，與既往研究結(jié)果相一致［12］，提示GPⅡb基因多態(tài)性可能與AIS發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，bb基因型患者PAC-1陽性血小板百分比高于aa基因型，提示攜帶b等位基因可能通過增強血小板早期活化程度而增加AIS發(fā)生風(fēng)險，分析其原因可能為基因突變導(dǎo)致GP表面纖維蛋白原受體的分布密度、形態(tài)和功能改變，血小板活化功能隨之改變，從而增加血栓性疾病如心肌梗死、AIS、深靜脈血栓形成等發(fā)生風(fēng)險［13］。

GPⅢa基因多態(tài)性是T1565C，即2號外顯子的1565T→C點突變導(dǎo)致第33位點處亮氨酸（HPA-la，PlA1）被脯氨酸（HPA-lb，PlA2）取代，稱為PlAl/A2同種抗原系統(tǒng)。FLOVD等［14］研究表明，腦梗死患者PlA2等位基因和PlA2/A2基因型頻率高于正常對照組，提示PlA2等位基因可能是腦梗死的獨立危險因素。TODINOVA等［15］研究表明，攜帶PlA2等位基因可能通過調(diào)節(jié)血小板細胞膜彈性、形態(tài)及活化狀態(tài)而促進血栓形成。但MAGUIRE等［16］研究卻發(fā)現(xiàn)，GPⅢa rs5918基因多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)生無關(guān)。本研究結(jié)果顯示，兩組受試者GPⅢa基因型和等位基因分布頻率間無統(tǒng)計學(xué)差異，且不同GPⅢa基因型患者PAC-1陽性血小板百分比間無統(tǒng)計學(xué)差異，提示GPⅢa基因多態(tài)性與AIS發(fā)生無關(guān)，分析其與既往研究結(jié)果不同的原因可能如下：（1）基因發(fā)揮作用受環(huán)境等多種因素影響；（2）不同種族、人群存在遺傳異質(zhì)性；（3）GPⅢa基因可能與AIS其他高危等位基因位點之間存在連鎖關(guān)系。

綜上所述，GPⅡb基因多態(tài)性與AIS的發(fā)生有關(guān)，攜帶b等位基因者可能通過增強血小板活化程度而增加AIS發(fā)生風(fēng)險，而GPⅢa基因多態(tài)性則與AIS的發(fā)生無關(guān)；但本研究為單中心研究，代表性有限，結(jié)果結(jié)論仍有待多中心聯(lián)合、前瞻性研究進一步證實。

作者貢獻：山媛進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，結(jié)果分析與解釋，負責(zé)撰寫論文，對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理；山媛、崔小麗進行研究的實施與可行性分析，論文的修訂；山媛、蔣鋒、梁導(dǎo)艷、孫晶瑩進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；蔣鋒負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。