徐挺亮,唐詩(shī)哲,彭 晶,陳行鋼,朱玉玲,周凱燕,周洪波

(中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410083)

酶是一種主要以微生物為來(lái)源的人類(lèi)需求產(chǎn)品。其中,淀粉酶是能夠水解淀粉和糖原的一類(lèi)酶的統(tǒng)稱(chēng),它是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用生產(chǎn),也是迄今產(chǎn)量最大、用途最廣的一種酶制劑[1]。根據(jù)淀粉酶水解淀粉作用的糖苷鍵和反應(yīng)產(chǎn)生的糖端基團(tuán)的不同,可將淀粉酶分為四大類(lèi):α-淀粉酶,系統(tǒng)名稱(chēng)為1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶,是一種從內(nèi)部隨機(jī)切開(kāi)淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子的α-1,4糖苷鍵的內(nèi)切型淀粉酶;β-淀粉酶,從底物還原性末端每相隔一個(gè)的α-1,4糖苷鍵順次水解;葡萄糖淀粉酶,從底物非還原性末端順次水解α-1,4糖苷鍵和分枝點(diǎn)α-1,6糖苷鍵,生成葡萄糖分子;異淀粉酶,只水解糖原或支鏈淀粉分枝點(diǎn)α-1,6糖苷鍵,從而切下側(cè)枝[2]。其中,α-淀粉酶是我國(guó)目前用途最廣、產(chǎn)量最大的工業(yè)酶制劑種類(lèi)之一,同時(shí)也是淀粉工業(yè)中最為重要的水解酶之一,在酶制劑生產(chǎn)中占有重要地位,在淀粉加工業(yè)、紙漿制造、紡織工業(yè)、釀造酒精及飼料加工業(yè)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[2～3]。

盡管α-淀粉酶可以來(lái)源于多種生物,包括動(dòng)物、植物和微生物,但是滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)需求的α-淀粉酶通常從微生物中獲得。目前,工業(yè)上生產(chǎn)的α-淀粉酶主要來(lái)源于5種常見(jiàn)的微生物,包括解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)[4]。其中,芽胞桿菌屬(Bacillus spp.)是α-淀粉酶主要的工業(yè)生產(chǎn)菌屬。

芽胞桿菌屬是一類(lèi)好氧或兼型厭氧的、能夠產(chǎn)生抗逆性芽胞的桿狀細(xì)菌,一般為革蘭氏陽(yáng)性,主要分布于土壤、植物體表以及水體中。其內(nèi)生孢子狀態(tài)對(duì)熱、紫外線(xiàn)、電磁輻射和部分化學(xué)藥品均具有很強(qiáng)的抗性[5]。芽胞桿菌是工業(yè)中十分常用的酶制劑生產(chǎn)菌株,一般能夠分泌許多種胞外產(chǎn)物,如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶及脂肪酶等[6]。盡管研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)芽孢桿菌可以產(chǎn)生胞外淀粉酶,但目前用于工業(yè)生產(chǎn)α-淀粉酶的芽胞桿菌菌株主要是解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)和枯草芽胞桿菌(B.subtilis)[4]。其他芽胞桿菌如嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)等也有作為α-淀粉酶生產(chǎn)菌株的報(bào)道[7～9]。

在傳統(tǒng)的芽胞桿菌屬工業(yè)生產(chǎn)α-淀粉酶中,由于處理步驟、溫度控制和pH等環(huán)境因素易于調(diào)控等優(yōu)勢(shì),液體深層發(fā)酵(submerged fermentation,SmF)是發(fā)酵方法的首選。而近年來(lái),α-淀粉酶的固態(tài)發(fā)酵(solid state fermentation,SSF)也已經(jīng)取得了很大進(jìn)展,正逐漸取代傳統(tǒng)的SmF[4]。

本文綜述了國(guó)內(nèi)外目前主要用于α-淀粉酶工業(yè)生產(chǎn)的芽胞桿菌屬菌株、發(fā)酵培養(yǎng)基及部分的發(fā)酵參數(shù),梳理了產(chǎn)α-淀粉酶芽胞桿菌的菌種選育的發(fā)展過(guò)程及當(dāng)前新型的育種手段,可為α-淀粉酶工業(yè)菌株選育和發(fā)酵生產(chǎn)提供新參考。

1 α-淀粉酶的種類(lèi)和性質(zhì)

隨著工業(yè)的不斷發(fā)展,人們對(duì)不同特性的α-淀粉酶的需求量不斷增加,研究者們目前已經(jīng)篩選并鑒定了上百種不同的α-淀粉酶[4]。根據(jù)最適作用溫度的不同,α-淀粉酶可以分為耐高溫、中溫和低溫3種類(lèi)型。

1.1 耐高溫α-淀粉酶

在目前的淀粉糖工業(yè)制備中,由于一般是在105～118℃的高溫環(huán)境下進(jìn)行淀粉噴射液化,所以α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性對(duì)下游產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用極為重要[10]。早在1973年,Saito等[11]對(duì)一株地衣芽胞桿菌分泌的耐高溫α-淀粉酶(B.licheniformis αamylase,BLA)的特性進(jìn)行了詳細(xì)的研究。結(jié)果顯示:該酶的相對(duì)分子質(zhì)量為22.5 kD,具有廣泛的pH適應(yīng)范圍,最適反應(yīng)pH和溫度分別為9.0和76℃。之后,林劍等[12]對(duì)B.licheniformis HM-3產(chǎn)生的BLA進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究,發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)pH為6.1～7.0;最適溫度范圍為75～85℃。張強(qiáng)[13]也報(bào)道了B.licheniformis Z-8所產(chǎn)BLA的最適反應(yīng)pH和溫度,分別為6.0和95℃。

產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的菌株主要是芽胞桿菌屬的微生物,如地衣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、凝結(jié)芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌。同時(shí),也有一些鏈球菌和古細(xì)菌產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶[14]。但目前工業(yè)生產(chǎn)上常采用地衣芽胞桿菌及其突變株。地衣芽胞桿菌適合生長(zhǎng)和發(fā)酵的溫度均比較高,一般發(fā)酵溫度達(dá)42℃,部分地衣芽胞桿菌菌株的最適發(fā)酵溫度甚至高于45℃[15]。

1.2 中溫α-淀粉酶

中溫耐熱型α-淀粉酶作用的最適溫度為50～70℃,90℃以上的處理一般會(huì)使其失活,而非耐熱性α-淀粉酶作用的最適溫度為50℃左右。在烘焙行業(yè)中,過(guò)量的α-淀粉酶常常會(huì)導(dǎo)致面包過(guò)粘,而中溫α-淀粉酶能夠在其淀粉糊化時(shí)具有活性,在焙烤過(guò)程中則逐漸失活,最終在焙烤完成時(shí)喪失活性[16]。因此,中溫α-淀粉酶在面包烘焙行業(yè)中具有不可替代的作用。

在淀粉酶制劑工業(yè)上,B.amyloliquefaciens BF7658菌株及以此菌株為基礎(chǔ)獲得的重組、突變菌株是主要的中溫α-淀粉酶生產(chǎn)菌株[2]。其中,中溫α-淀粉酶基因主要來(lái)源于兩種芽胞桿菌:解淀粉芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌,二者產(chǎn)生的中溫α-淀粉酶分別被稱(chēng)為解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶(B.amyloliquefaciens α-amylase,BAA)和枯草芽胞桿菌 α-淀粉酶(B.subtilis α-amylase,BSA)。這兩種α-淀粉酶的理化特性有著明顯的區(qū)別:BAA屬液化型,而B(niǎo)SA為糖化型。相比之下,BAA的酶學(xué)性能略?xún)?yōu)于BSA,是市場(chǎng)和工業(yè)應(yīng)用中的主要酶種[17]。劉洋等[18]對(duì) B.amyloliquefaciens M23 產(chǎn)生的BAA進(jìn)行了一系列酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè),結(jié)果顯示:該酶的相對(duì)分子質(zhì)量為58 kD,最適反應(yīng)溫度為55℃,最適反應(yīng)pH為6.0;在55℃條件下保溫15 min基本喪失活力,而在添加10 mmol/L的Ca2+條件下能顯著提高酶的熱穩(wěn)定性。目前,一般工業(yè)應(yīng)用中BAA的相對(duì)分子質(zhì)量大多在50～60 kD,在40～60℃范圍內(nèi)有較高的穩(wěn)定性,其最適作用溫度約為60℃,最適作用pH為6.0～7.0,并且其酶活對(duì)Ca2+有很強(qiáng)依賴(lài),在弱堿環(huán)境下較為穩(wěn)定[2]。由于生產(chǎn)BAA的解淀粉芽胞桿菌發(fā)酵最適溫度較低,一般需控制在34℃以下,所以該菌發(fā)酵過(guò)程中將耗費(fèi)大量冷卻用水[17]。

1.3 低溫α-淀粉酶

淀粉是單胃動(dòng)物能量的主要來(lái)源,幼齡動(dòng)物由于消化系統(tǒng)發(fā)育不成熟,淀粉酶往往分泌不足,此時(shí)通過(guò)補(bǔ)充外源性營(yíng)養(yǎng)消化酶能夠在一定程度上彌補(bǔ)該缺陷。然而動(dòng)物生理環(huán)境溫度一般為37～42℃,中溫α-淀粉酶在動(dòng)物消化道內(nèi)可發(fā)揮的作用甚微[19]。低溫α-淀粉酶的最適作用溫度相對(duì)于中溫α-淀粉酶要低20～30℃,在0℃下仍具有一定的活性,適合作為動(dòng)物外源性營(yíng)養(yǎng)消化酶。此外,低溫α-淀粉酶也廣泛用于饅頭制作等過(guò)程[20]。

低溫α-淀粉酶在枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌等菌種中均有報(bào)道[21～23]。Ikawa等[24]分離到一種來(lái)源于枯草芽胞桿菌,以不同的水解效率水解可溶性淀粉、支鏈淀粉、糖原、直鏈淀粉、葡聚糖等多種底物的低溫α-淀粉酶,其相對(duì)水解率(可溶性淀粉為100%)分別為100%、133%、94%、39%、12%。該酶在45℃下十分穩(wěn)定,但在60℃下幾乎完全失活。2017年,竇少華等[25]發(fā)現(xiàn)了一株來(lái)源于海洋的產(chǎn)低溫α-淀粉酶的菌株Bacillus thuringiensis dsh19-1,該菌株的最適生長(zhǎng)溫度為20℃,發(fā)酵粗酶液最適作用溫度為20℃。由于低溫α-淀粉酶成本高于目前的商業(yè)用酶,因此該酶在應(yīng)用推廣上還存在一定的困難[26]。

2 生產(chǎn)菌株選育研究現(xiàn)狀

2.1 誘變育種

誘變育種作為工業(yè)菌株育種的重要方法之一,它具有操作簡(jiǎn)便、速度快、收效大等優(yōu)勢(shì)。經(jīng)過(guò)對(duì)菌株不斷地誘變改良,目前工業(yè)上所用菌種產(chǎn)生α-淀粉酶的能力得到了很大的提高。潘風(fēng)光等[27]認(rèn)為,誘變處理能夠改變或破壞芽胞桿菌中部分酶的合成調(diào)控機(jī)制及其分泌調(diào)節(jié)機(jī)制,首先篩選出抗代謝阻遏的突變株或者蛋白質(zhì)分泌能力提高的突變株,隨后通過(guò)多輪誘變處理,逐漸積累有益的、有效的基因突變位點(diǎn),最終獲得α-淀粉酶高產(chǎn)突變菌株。傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變方法有紫外誘變法、亞硝基乙基脲法、甲基磺酸乙酯法等。近年來(lái),許多新型的誘變方法被用于芽胞桿菌以提高其酶產(chǎn)量或改變菌株特性。例如:Cregenzán-Alberti等[28]利用高溫脈沖電場(chǎng)誘變處理B.subtilis DSM618的內(nèi)生孢子,得到的突變株在123℃的條件下更具耐熱性;Ma等[29]報(bào)道,通過(guò)常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變包含有重組質(zhì)粒的B.subtilis 168,重組質(zhì)粒中堿性α-淀粉酶的產(chǎn)酶效率從1.31 U/(mg·h)增加至1.57 U/(mg·h);Ma等[30]還利用ARTP方法對(duì)B.subtilis WB600菌株進(jìn)行誘變處理,發(fā)現(xiàn)其α-淀粉酶活力較出發(fā)菌株提高了35%;趙天惠等[31]利用脈沖強(qiáng)光誘變,經(jīng)初篩和復(fù)篩,獲得了兼具耐受高溫、強(qiáng)酸、高濃度鹽的變異菌株B3和B7,其產(chǎn)出的α-淀粉酶的酶活比原始菌株分別提高了67%、77%;鄢洪德等[32]采用超臨界CO2誘變B.subtilis K2,發(fā)現(xiàn)其所產(chǎn)淀粉酶的活力提高了33%。盡管誘變能夠獲得酶活較高和耐受性較強(qiáng)的突變株,但誘變菌株的穩(wěn)定性一般較差,需要經(jīng)過(guò)傳代檢驗(yàn)以保證其性質(zhì)能夠遺傳[27]。另外,由于誘變后同時(shí)存在著大量的正、負(fù)突變,所以為了快速獲得酶活提高很大的突變菌株,高通量篩選方法的建立才是誘變育種需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

2.2 基因工程育種

基因工程育種可通過(guò)將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入受體細(xì)胞的方式或通過(guò)對(duì)菌種自身基因的精確修飾來(lái)達(dá)到功能性目的,是在分子水平上對(duì)工業(yè)微生物菌種進(jìn)行的遺傳操作[33]。迄今,構(gòu)建基因工程菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)α-淀粉酶的例子已經(jīng)越來(lái)越多。

早在1978年,Nomura等[34]就使用基因工程技術(shù)將整合有amyE基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌,得到具有產(chǎn)α-淀粉酶能力的轉(zhuǎn)化菌株。1981年,Palva等[35]使用pUB110作為運(yùn)載體將來(lái)源于B.amyloliquefaciens的α-淀粉酶基因克隆到B.subtilis中,篩選出了抗卡拉霉素的B.subtilis基因工程菌株,由于基因拷貝數(shù)和質(zhì)粒上啟動(dòng)子的改變,其α-淀粉酶活力比原始的野生型菌株高500倍。1987年,Vehmaanper?等[36]也成功克隆了 BAA酶基因,將其進(jìn)行重組后獲得了B.subtilis ALKO-84,并用于工業(yè)化生產(chǎn)α-淀粉酶。由于游離質(zhì)粒存在無(wú)抗生素壓力下易丟失的特點(diǎn),在生產(chǎn)過(guò)程中需要投入較多相應(yīng)的抗生素。1998年,王磊等[37]建立了一套整合載體,將來(lái)自嗜熱脂肪芽胞桿菌的高溫α-淀粉酶基因以及一段氯霉素抗性基因隨機(jī)整合到B.subtilis 1A289的染色體上,并通過(guò)提高菌株的抗氯霉素能力以及重復(fù)地進(jìn)行整合步驟,不斷提高整合到染色體上高溫α-淀粉酶基因的拷貝數(shù),最終將拷貝數(shù)增至7個(gè)以上。在無(wú)抗生素選擇壓力的情況下,該菌種仍能保持產(chǎn)酶220 U/mL。相較游離質(zhì)粒型的基因工程菌,該菌產(chǎn)酶穩(wěn)定性良好,從根本上克服了早期質(zhì)粒型基因工程菌的質(zhì)粒易丟失的現(xiàn)象。2009年,牛丹丹等[38]將α-淀粉酶編碼基因amyL導(dǎo)入BLA生產(chǎn)菌中,使該菌α-淀粉酶的產(chǎn)量提高了約89.2%。此外,2017年,李由然等[39]成功實(shí)現(xiàn)了由新興的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)介導(dǎo)的B.lichenifor-mis ATCC14580淀粉酶編碼基因amyL的敲除,在該菌絕大多數(shù)α-淀粉酶喪失活性的條件下,其生長(zhǎng)速率仍未受到顯著影響。李由然團(tuán)隊(duì)將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功運(yùn)用于地衣芽胞桿菌基因組的編輯,為應(yīng)用這種新型的基因編輯工具于該菌基因功能研究及菌種改造提供了參考。

3 發(fā)酵研究現(xiàn)狀

芽孢桿菌屬工業(yè)化生產(chǎn)α-淀粉酶的大規(guī)模發(fā)酵制備方法主要分為兩種:液體深層發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵[40]。

3.1 α-淀粉酶的液體深層發(fā)酵

通常,由于液體發(fā)酵具有對(duì)溫度、pH、通氣量、溶氧和水分等過(guò)程參數(shù)控制方便,使用商業(yè)化的培養(yǎng)基配方,滅菌和最終產(chǎn)品的純化過(guò)程容易等優(yōu)點(diǎn),工業(yè)上優(yōu)先選用液體深層發(fā)酵來(lái)對(duì)微生物酶制劑進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)。但是,這種方法對(duì)底物消耗較快,需要在發(fā)酵過(guò)程中不斷進(jìn)行流加補(bǔ)充[4]。早在1917年,一種來(lái)自枯草芽胞桿菌的α-淀粉酶就被認(rèn)為是適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的酶。但直到1950年左右,這種酶才開(kāi)始進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn),并借鑒和引入了當(dāng)時(shí)抗生素工業(yè)常用的液體發(fā)酵[41]。α-淀粉酶是一種誘導(dǎo)酶,通常在淀粉或者其水解產(chǎn)物存在的條件下被誘導(dǎo)。芽胞桿菌屬中不同菌種對(duì)培養(yǎng)基中不同的底物具有特異性。例如:對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)中溫α-淀粉酶常用的B.amyloliquefaciens BF7658,其誘導(dǎo)效果依次是可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇、阿拉伯糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖[42]。此外,李志鵬[2]對(duì)B.amyloliquefaciens YL1-5(B.amyloliquefaciens BF7658變異株)的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化后的培養(yǎng)基為玉米粉16%、棉籽餅粉8%、玉米漿粉1.0%、沸石1.0%、CaCO30.8%,其采用的底物均為易得的富含淀粉類(lèi)的農(nóng)副產(chǎn)品。Syu等[43]對(duì)一株產(chǎn)α-淀粉酶的B.amyloliquefaciens(ATCC 23350,CCRC 10268)的發(fā)酵結(jié)果的分析顯示:以葡萄糖為碳源時(shí),細(xì)菌生長(zhǎng)速度很快,而以麥芽糖為碳源時(shí)能夠獲得相對(duì)較高的生物量、酶活力和產(chǎn)酶效率。李習(xí)[44]通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)B.licheniformis BG14的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,采用黃豆粉0.7%、麩皮1.0%、可溶性淀粉0.5%、蛋白胨1.0%、K2HPO40.5%作為發(fā)酵培養(yǎng)基,結(jié)果顯示:該菌在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中所產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的活力達(dá)到334.32 U/mL,比初始發(fā)酵培養(yǎng)基的酶活力提高43.09%。范如意等[15]優(yōu)化了B.licheniformis CBBD302產(chǎn)高溫α-淀粉酶的發(fā)酵培養(yǎng)基底物,將碳氮源由乳糖和豆餅粉改為木糖和豆餅粉,提高了其產(chǎn)酶量。表1顯示了其他部分芽胞桿菌屬菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中使用的培養(yǎng)基底物及其酶活產(chǎn)量,為研究者對(duì)各類(lèi)菌株選擇相對(duì)應(yīng)的底物提供參考。從表1中可知,大多數(shù)培養(yǎng)基配方使用淀粉類(lèi)作為液體培養(yǎng)基中的主要底物和主要碳源。

不同菌種的溫度、pH、通氣量、溶氧和水分等發(fā)酵參數(shù)有很大的差異,研究者需要結(jié)合選用的菌株、發(fā)酵設(shè)備、產(chǎn)地氣候及生產(chǎn)成本等方面綜合進(jìn)行考慮。例如:對(duì)于解淀粉芽胞桿菌這類(lèi)好氧菌,發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中通氣十分重要。研究表明,如果在3 L攪拌罐生物反應(yīng)器中增加1 vvm的通氣量,解淀粉芽胞桿菌所產(chǎn)淀粉酶的活力將增加至2倍[45]。一般來(lái)說(shuō),較低的攪拌速度對(duì)解淀粉芽胞桿菌的α-淀粉酶的合成會(huì)更有利[46]。此外,在大規(guī)模發(fā)酵罐生產(chǎn)中,消除氣泡也是一個(gè)關(guān)鍵因素。尤其在菌體生長(zhǎng)期和產(chǎn)物合成期,消除泡沫更為重要,否則極易造成漫灌跑液、染雜菌、降低產(chǎn)量等一系列不利影響[47]。

3.2 α-淀粉酶的固態(tài)發(fā)酵

固態(tài)發(fā)酵被定義為在沒(méi)有或幾乎沒(méi)有游離水的情況下發(fā)生的發(fā)酵過(guò)程,適用于生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)水分要求較低的微生物[56]。它在生物浸出、生物選礦、生物修復(fù)、生物制漿等過(guò)程中均有應(yīng)用,有著許多的優(yōu)點(diǎn),如:較高的發(fā)酵生產(chǎn)率、產(chǎn)品最終濃度和產(chǎn)品穩(wěn)定性;較低的代謝抑制率;對(duì)發(fā)酵過(guò)程無(wú)菌性要求較低;設(shè)備要求簡(jiǎn)單;廢料可再利用;污水產(chǎn)生少等[4]。雖然傳統(tǒng)上SmF一直用于工業(yè)生產(chǎn)酶制劑。但隨著SSF反應(yīng)器設(shè)計(jì)的不斷改進(jìn),具有優(yōu)化生產(chǎn)參數(shù)的SSF對(duì)進(jìn)一步提高淀粉酶產(chǎn)量具有巨大的潛力。吳大治等[3]針對(duì)B.amyloliquefaciens BF7658的一株變異菌種,直接以麩皮為原料的固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)α-淀粉酶。其采用的初始條件為:培養(yǎng)基初始含水量60%,起始pH自然,液體接種量5 mL/kg,37～39℃下發(fā)酵48～60 h。結(jié)果顯示:SSF法產(chǎn)α-淀粉酶的水平為SmF法的4～5倍,并且成本更加低廉。α-淀粉酶生產(chǎn)菌株B.licheniformis M27在含有15%葡萄糖的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)后,其發(fā)酵液酶活為19.550 U/mL,而該菌在以相同百分比(150 mg/g)的小麥麩皮作為固態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵后,其酶活水平為1 450 U/gds(每克初始干物質(zhì))[57]。在SSF的固態(tài)培養(yǎng)基中,麥麩似乎是許多α-淀粉酶生產(chǎn)研究者首選的基質(zhì)。表2列舉了其他一些菌株使用相應(yīng)的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物、廢棄物作為底物,進(jìn)行SSF生產(chǎn)所得α-淀粉酶的酶活。表2表明:除麩皮外,其他農(nóng)業(yè)廢棄物如香蕉皮、土豆皮、胡瓜皮、香蕉殘穗,以及在農(nóng)產(chǎn)品加工過(guò)程中產(chǎn)生的殘?jiān)缑卓?、蔗渣、花生油渣、扁豆殼?都是SSF產(chǎn)α-淀粉酶的有效底物。此外,SSF的成功很大程度上取決于控制合適的活化期、接種量、水分含量和pH等條件,這些參數(shù)對(duì)于不同菌種的差異性較大,需要研究者針對(duì)所選用菌株進(jìn)行相關(guān)探索。

3.3 無(wú)機(jī)鹽等微量組分對(duì)α-淀粉酶產(chǎn)量的影響

磷酸鹽在微生物的一級(jí)和二級(jí)代謝產(chǎn)物的合成中起重要作用,會(huì)影響到微生物的生長(zhǎng)和α-淀粉酶的產(chǎn)量。根據(jù)不同菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶需要,磷酸鹽的添加量也略有差異[64]。例如:李志鵬[2]在搖瓶水平進(jìn)行B.amyloliquefaciens YL1-5的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí),添加了0.5%Na2HPO4和0.45%NaH2PO4,既為菌株提供了適量的磷酸鹽,也對(duì)發(fā)酵液的pH起到了緩沖作用。一般地,低濃度的磷酸鹽會(huì)導(dǎo)致芽胞桿菌的細(xì)胞濃度降低,酶合成延滯,而高濃度的磷酸鹽在芽胞桿菌產(chǎn)酶過(guò)程中也會(huì)降低α-淀粉酶的產(chǎn)量[42]。

通常,培養(yǎng)基中CaCl2和MgSO4的添加會(huì)增加 α-淀粉酶的產(chǎn)量,而且 Mg2+、Ca2+、Na+對(duì) α-淀粉酶的產(chǎn)量和酶活發(fā)揮主要作用[65]。其中,除少數(shù)Ca2+非依懶型α-淀粉酶外,Ca2+對(duì)工業(yè)生產(chǎn)的α-淀粉酶的穩(wěn)定性起到關(guān)鍵作用[66]。例如:在上述報(bào)道的解淀粉芽胞桿菌和地衣芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中,均添加了少量Ca2+,分別為1.6%的CaCO3和 0.3%的 CaCl2[2,15]。

一般認(rèn)為,培養(yǎng)基中的肌醇、D-山梨糖醇等單糖及吐溫80、Triton X-100等洗滌劑會(huì)抑制淀粉酶的產(chǎn)量,而其他的無(wú)機(jī)和有機(jī)鹽如KCl、蘋(píng)果酸鈉和琥珀酸鉀等則有利于淀粉酶產(chǎn)量增加。此外,在培養(yǎng)基中加入氨基酸如異亮氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸也被發(fā)現(xiàn)對(duì)淀粉酶生產(chǎn)至關(guān)重要[67]。

表1 液體深層發(fā)酵中部分芽胞桿菌屬菌株所產(chǎn)α-淀粉酶的酶活Table 1 Bacillus spp.α-amylase activity in SmF

表2 固態(tài)發(fā)酵中部分芽胞桿菌屬菌株所產(chǎn)α-淀粉酶的酶活Table 2 Bacillus spp.α-amylase activity in SSF

4 結(jié)語(yǔ)

誘變育種產(chǎn)生突變的位置是隨機(jī)的,該方法具有高度不確定性。短時(shí)間內(nèi)使用誘變育種難以大幅度提高酶的活力,需要反復(fù)進(jìn)行大量的篩選工作才能獲得較理想的突變菌株?；蚬こ屉m然能通過(guò)精確修飾改造微生物,但要求的技術(shù)難度較高,且對(duì)于一些來(lái)源不明的外源基因需要進(jìn)行嚴(yán)格審查。研究者們應(yīng)該結(jié)合菌種的實(shí)際情況,選擇相應(yīng)的誘變或基因工程改造手段,以獲得生產(chǎn)產(chǎn)能更高、耐受性更強(qiáng)的α-淀粉酶生產(chǎn)菌株。在芽胞桿菌屬α-淀粉酶發(fā)酵工業(yè)中,發(fā)酵培養(yǎng)基底物的選擇對(duì)α-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)起著至關(guān)重要的作用。其中,新興的固體發(fā)酵法在產(chǎn)α-淀粉酶過(guò)程中能夠更好地利用農(nóng)業(yè)及農(nóng)產(chǎn)品加工過(guò)程中的廢棄物作為發(fā)酵培養(yǎng)基,是一種既高能效又環(huán)境友好的生產(chǎn)方式。此外,發(fā)酵工藝參數(shù)等細(xì)節(jié)的改良也能夠提高α-淀粉酶的產(chǎn)量。

隨著科技的進(jìn)步、工業(yè)的發(fā)展,以及國(guó)家對(duì)環(huán)境保護(hù)的重視,淀粉酶在發(fā)酵、食品、糧食加工、造紙、紡織等輕工業(yè)的運(yùn)用更加廣泛。未來(lái)對(duì)不同酶學(xué)性質(zhì)的α-淀粉酶也將有更廣泛的需求,通過(guò)尋找極端環(huán)境微生物中新的α-淀粉酶編碼基因或者通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并改造已有的基因序列是開(kāi)拓新型α-淀粉酶市場(chǎng)、開(kāi)發(fā)新應(yīng)用領(lǐng)域的有效途徑。此外,雖然α-淀粉酶發(fā)酵產(chǎn)業(yè)已經(jīng)較為成熟,但其下游工藝(酶的分離、純化等)仍占據(jù)著主要生產(chǎn)成本。通過(guò)構(gòu)建缺陷性(如:蛋白酶缺陷性)或良好的選擇性通透型菌株以產(chǎn)生純度更高的發(fā)酵液,或者完善下游分離產(chǎn)業(yè)工藝,是解決該問(wèn)題的主要途徑。相信隨著生產(chǎn)成本的降低和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展,α-淀粉酶將在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮更大作用。