秦利均,楊永柱,楊星勇*

(1.重慶師范大學生命科學學院,中國重慶401331;2.重慶市九龍坡區(qū)農業(yè)委員會,中國重慶401331)

磷是植物正常生長發(fā)育所必需的礦質元素,參與植物呼吸作用、細胞分裂、能量轉化和生物合成等重要的生理生化過程。土壤中的磷以無機磷和有機磷兩種形式存在,雖然存儲量大,但其中約95%的磷不能被植物直接吸收利用[1]。據(jù)統(tǒng)計,全世界約有43%的耕地土壤缺乏能被植物吸收利用的有效磷,而我國土壤中缺少有效磷的耕地占70%以上[2]。為保證農業(yè)生產需求,人們常常通過大量施用磷肥來彌補有效磷的供應[3]。但植物對其利用率較低,當季利用率僅有5%～25%,肥料中 80%以上的磷與土壤中的 Fe3+、Ca2+、Mg2+、Al3+等陽離子結合為難溶性的磷酸鹽,不能被植物吸收利用,這使磷成為植物生長發(fā)育的限制因素[4～5]。農業(yè)生產用磷肥開采自磷酸巖,而按目前的開采速度,全球磷酸巖儲量將在50～100年內耗盡[6]。此外,磷肥的大量使用又會導致土壤養(yǎng)分失衡,誘發(fā)微量元素如鐵、鋅的缺乏。因此,如何提高土壤磷的利用率成為熱點問題之一,溶磷微生物(phosphate solubilizing microorganisms,PSMs)作為土壤磷循環(huán)中的重要成員也成為研究焦點。

1 土壤磷素及溶磷微生物

土壤中不能被植物吸收利用的磷分為有機態(tài)磷和無機態(tài)磷。有機態(tài)磷來源于動植物和人類活動等,主要包括磷脂、植酸類、核酸、磷蛋白等,需通過礦化作用分解為無機磷才能供植物吸收利用。無機態(tài)磷主要包括土壤中難溶的礦物態(tài)磷,如Ca-P、Fe-P、Al-P化合物等形式,需將其溶解為可溶性的磷酸根離子后才能被植物吸收[7]。

自然界中,土壤溶磷微生物是土壤磷循環(huán)中的重要一員,能將無效磷轉化為有效磷供植物吸收。溶磷菌的活動不僅能為植物提供足夠的有效磷,還能分泌生長素等植物生長調節(jié)劑促進植物生長[8]。此外,部分溶磷菌還可以分泌嗜鐵素[9]、抗生素以及ACC脫氨酶等[10]。同時,也有部分溶磷菌能提高重金屬土壤的生物修復效率[11]。研制環(huán)境友好型的溶磷菌菌肥[12],并將其替代傳統(tǒng)化肥,可減少環(huán)境污染、改良土質、增加土壤肥力。

溶磷微生物主要包括溶磷細菌(phosphate solubilizing bacteria,PSB)、溶磷真菌(phosphate solubilizing fungi,PSF)和溶磷放線菌(phosphate solubilizing actinomycete,PSA)。在土壤中,溶磷細菌占PSMs總量的1%～50%[13],主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)和沙雷氏菌屬(Serratia)等;溶磷真菌僅占0.1%～0.5%[14],主要有青霉菌屬(Penicillium)、曲霉菌屬(Aspergillus)、AM菌根屬(Arbusclar mycorrhiza)等;溶磷放線菌主要有鏈霉菌屬(Streptomyces)和小單胞菌屬(Micromonospora)等[14]。

溶磷菌的溶磷、解磷過程十分復雜,其潛在機制也因菌種不同而各不相同。其可能機制如圖1所示,主要包括有機酸酸解作用、酶解作用和釋放H+等[15]。其相關溶磷、解磷效率[16～19]如表 1 所示。目前,對PSMs溶磷、解磷機制認識的局限性限制了溶磷菌及相關菌肥的廣泛應用。

2 無機礦物磷溶解途徑

無機礦物磷的溶解主要與PSMs中小分子有機酸的分泌有關[20]。PSMs產生的有機酸包括葡萄糖酸、草酸、酮基葡萄糖酸、蘋果酸、檸檬酸等[21～22]。PSMs菌種不同,其產酸的種類和含量也各不相同,溶磷能力也不一樣[23]。將檸檬酸和草酸添加到土壤中,能有效提高土壤的溶磷效率。關連珠等[24]發(fā)現(xiàn),草酸和植酸酶的使用能顯著提高土壤有效磷的含量。

溶磷菌分泌的有機酸能夠降低土壤pH,促進微溶的礦質磷溶解(包括磷酸鈣和磷灰石等)[25];同時能與 Fe3+、Ca2+、Mg2+、Al3+等陽離子螯合,即有機酸離子與Pi在土壤中競爭(直接物理競爭或靜電競爭)相同的吸附位點[26],釋放磷酸根離子。已有研究報道,歐文氏菌(Erwinia)對磷礦石的高效溶解是由于葡萄糖在葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase,GDH)催化下發(fā)生直接氧化反應(非磷酸化氧化)產生葡萄糖酸[27～28];而葡萄糖酸通過介導直接酸化途徑溶解磷礦石,使其在葡萄糖酸含量相對較低的情況下,也能釋放大量的Pi[29]。此外,根據(jù)菌種的不同,有的溶磷微生物可將葡萄糖酸進一步氧化為2-酮基葡萄糖酸。相比葡萄糖酸,2-酮基葡萄糖酸具有更高的溶磷效率[30]。

一些PSMs在GDH相關基因突變失活后不能溶解石灰性土壤中的難溶磷酸鹽[31]。吡咯喹啉醌(pyr-roloquinoline quinone,PQQ)作為GDH的輔酶,共同參與葡萄糖等碳源的無機磷代謝,并起著重要的調控作用[31]。焦子偉等[32]將水生拉恩氏菌(Rahnella aqautills)HX2菌株的pqq基因簇導入大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α,結果顯示:工程菌株DH5α能分泌更多的有機酸,特別是葡萄糖酸,與原菌株相比,工程菌株DH5α擁有更強的溶解礦質磷能力。類似的還有分離自洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)的礦物磷酸鹽溶解基因gabY[33],其與pqq基因沒有明顯同源性,可在直接氧化途徑表達或(和)調控中發(fā)揮替代作用,增加溶磷能力[27,34]。

表1 溶磷微生物的溶磷、解磷相關指標[16～19]Table 1 Phosphorus solubilization and dissolution indicators of PSMs

圖1 溶磷微生物(PSMs)溶解難溶性磷的潛在機制PSF:溶磷真菌;PSB:溶磷細菌;PSA:溶磷放線菌。Fig.1 Potential mechanisms for the solubilization of insoluble phosphorus by PSMsPSF:Phosphate solubilizing fungi;PSB:Phosphate solubilizing bacteria;PSA:Phosphate solubilizing actinomycete.

有些PSMs只有在NH4+存在時才能溶解無機磷酸鹽。Halder等[35]發(fā)現(xiàn)有的固氮菌需要NH4+的存在才能溶解羥基磷灰石;Asea等[36]發(fā)現(xiàn),相比于以NO3-為唯一氮源,以NH4+為唯一氮源時,培養(yǎng)介質pH顯著降低,溶磷菌溶磷量顯著增加。NH4+同化作用過程中,利用ATP轉換時產生的能量,通過質子泵釋放H+,使pH降低,從而有助磷的溶解[20,37]。土壤pH與溶磷效率有一定的相關性,但pH的下降并不是微生物溶磷的必要條件[38]。

此外,有一些PSMs在土壤難溶磷的溶解過程中起著補充作用。例如:土壤中的硫桿菌(Thiobacillus)通過產生的H2S與Fe-P化合物反應生成FeSO4,從而釋放出磷酸根離子[39];桔灰青霉菌(Penicillium aurantiogriseum)不分泌有機酸,通過吸收Ca2+,從而釋放磷酸根以溶解鈣磷酸鹽[40];還有些PSMs產生的胞外多糖能夠顯著增強溶磷作用,并通過呼吸作用產生CO2,導致pH降低,使部分磷酸鹽溶解[41]。有研究表明:溶磷微生物分泌的磷酸酶也能夠溶解無機難溶磷,如已經確定的無機磷酸酶——焦磷酸水解酶,它可以將焦磷酸鹽水解為磷酸鹽離子,且其酶活性在一定范圍內隨pH增高而增加[42]。

3 有機磷溶解途徑

有機磷的礦化主要依靠酶解作用,這些酶包括磷酸酶、植酸酶、C-P裂解酶、核酸酶等[43]。其中,磷酸酶和植酸酶(肌醇六磷酸酶)最為常見,它們的底物主要存在于土壤中[44]。

磷酸酶包括酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、磷酸二酯酶和無機焦磷酸酶等,能水解磷酸酯鍵釋放無機磷酸。根據(jù)底物特異性,磷酸酶還可進一步分為特異性磷酸酶和非特異性磷酸酶。磷酸單酯酶可以從磷酸單酯化合物中解離磷酸基團;而磷酸二酯酶可以水解核酸中的磷酸二酯鍵。植酸酶可通過催化肌醇六磷酸中磷酸單酯鍵的水解,釋放出肌醇磷酸酯和無機磷酸酯[45]。C-P裂解酶裂解有機磷酸酯的C-P鍵。D-α-甘油磷酸酶是一種稀土磷酸酶,由其催化的反應產物被鑒定為甘油和無機磷酸鹽[46]。此外,有報道指出許多酶都可以作為有機磷酸酯清除劑,從核苷酸和糖磷酸中釋放無機磷酸鹽[47]。

磷酸酶隨著pH的變化,顯示出不一樣的催化能力。在pH小于6時,酸性磷酸酶占優(yōu)勢;pH大于7時,堿性磷酸酶更普遍。根據(jù)已分離出來的磷酸酶基因及其特征,人們將非特異性磷酸酶分為 A、B、C 三類[48～50]。Rossolini等[51]從摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)和斯氏普羅威登斯菌(Providencias tuartii)分離出具有高度同源性的A類磷酸酶基因,并經研究表明這些基因垂直衍生自共同的祖先;同時,該團隊還證實了各細菌磷酸酶家族(A、B和C)存在各種保守結構域和特征基序。在酸性或中性的土壤條件下,由acpA、phoC和napA等基因編碼的酸性磷酸酶表現(xiàn)出較強溶磷活性。Fraga等[52]從摩氏摩根氏菌(M.morganii)克隆了napA基因,將其轉移到洋蔥伯克氏菌(Burkholderia cepacia)IS-16中后,后者酸性磷酸酶活性明顯提高,溶磷能力顯著增強。

磷酸酶的產生主要是通過無機磷酸鹽(Pi)濃度進行調節(jié)。當處于低Pi條件下時,涉及Pi信號轉導的操縱子調控元件被由PhoB構成的PHO調節(jié)因子激活,堿性磷酸酶(phoA基因編碼)被大量表達;隨著Pi的濃度增加,堿性磷酸酶的活性受到抑制[53]。

大多數(shù)堿性磷酸酶受Pi抑制調控,但部分酸性磷酸酶,如摩氏摩根氏菌(M.morganii)和斯氏普羅威登斯菌(P.stuartii)產生的不被大量磷酸鹽抑制的A類酸性磷酸酶(phoC基因編碼)和不被少量磷酸鹽抑制的B類酸性磷酸酶(napA基因編碼),均表現(xiàn)出不被高水平磷酸鹽抑制的特有磷酸酶活性調控模式[54～55]。除此之外,磷酰乙醛水解酶和C-P裂解酶也僅在磷酸鹽限制條件下被誘導[56～57]。在熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)MF3菌株中,編碼酸性磷酸酶的apo基因的表達受生長溫度調節(jié);在福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)中,編碼三磷酸腺苷雙磷酸水解酶的apy基因,以及其他相關等位基因均以溫度調節(jié)方式表達[58]。

小分子有機酸也可促進有機磷的礦化。Patel等[59]發(fā)現(xiàn),在有機酸陰離子(如葡萄糖酸鹽、檸檬酸鹽)的存在下,肌醇六磷酸鈣(植酸鈣)的水解效率得到提高。有機酸陰離子的存在可以改善肌醇六磷酸鈣鹽的溶解性,從而提高解磷效率。其增溶機理與植酸酶的水解是互補的,有機酸陰離子通過與二價金屬螯合作用提高肌醇六磷酸酶活性,但其確切的機制仍不清楚[60]。

4 展望

我國乃至全世界耕地土壤缺磷現(xiàn)象普遍較重,土壤中磷素的固定和轉化效率影響土壤磷的積累及利用?；谕寥廊芰孜⑸锏膬?yōu)點,針對PSMs研制相關菌肥是提高土壤有效磷含量,促進植物生長發(fā)育,發(fā)展可持續(xù)農業(yè)的重要手段之一。研制PSMs菌肥,我們所面臨的挑戰(zhàn)還有很多,例如:實驗室培養(yǎng)的高效溶磷菌無法在自然環(huán)境中占據(jù)優(yōu)勢地位,生存能力差,溶磷、解磷能力退化或受到極大抑制。

為改善土壤磷的利用效率,對PSMs的溶磷、解磷機制研究必不可少。未來可從以下幾個方面展開深入研究:1)從溶磷菌在土壤中的生態(tài)關系入手,即探究土壤pH、深度、溫度和海拔等對溶磷菌的生存和溶磷、解磷能力的影響;2)很多組合菌肥比單一菌肥有著更強的生存能力和溶磷、解磷能力,深入解析其差異,有利于制備更高效的PSMs菌肥;3)分離克隆溶磷、解磷相關基因,了解其表達調控機制,利用基因工程手段改良溶磷菌株,得到更高效的溶磷菌株。

相信隨著研究的深入,PSMs菌肥能代替化肥促進植物生長,提高土壤有效磷含量,同時改善土壤環(huán)境,降低環(huán)境污染,使農業(yè)生產更好更快的發(fā)展。