李嘉,張玲 ,李妍 ,穆潤清
(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1. 門診采血中心;2. 腫瘤研究所生物治療室;3. 檢驗科,沈陽 110001)
早在1948年,學(xué)者MANDEL等[1]就報道了血漿中游離DNA (cell-free DNA,cfDNA) 的存在。由于其含量較少,且大多為小分子片段DNA[2],提取較困難,在提取過程中常會丟失一部分DNA,導(dǎo)致檢驗的相對靈敏度降低,影響實驗及臨床結(jié)果的真實性,也由此限制了血漿cfDNA在臨床診斷中的應(yīng)用。最近的研究顯示,腫瘤患者血漿中cfDNA的含量顯著高于正常健康人群血漿中的含量,且檢測出的突變基因可用于指導(dǎo)腫瘤的靶向治療。關(guān)于在獲取腫瘤患者的血液樣本后,血液存放溫度和存放時間對cfDNA檢測結(jié)果是否有影響目前尚未明確。本研究擬檢測采血后不同存放時間及溫度下血漿中cfDNA的含量,并比較其提取效率,探討最佳的分離處理時間,為臨床上提高分離提取cfDNA的效率提供正確的指導(dǎo)。
DNA提取試劑盒 (QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit,德國QIAGEN公司) 、DNA濃度檢測試劑盒(中國上海晶抗生物公司) 。DNA濃度檢測儀 (Qubit,美國Invitrogen公司) 。
1.2.1 采集血液標本:血液樣本采自50例健康志愿者,其中男30例,女20例,年齡25~65歲,平均年齡43歲。抽取空腹外周靜脈血至EDTA抗凝采血管 (5 mL/管,7管/人) ,然后將其分別置于4 ℃、25 ℃,并分別存放2 h、6 h、24 h,以備后續(xù)實驗。
1.2.2 提取cfDNA:取不同存放時間及存放溫度的全血樣本5 mL,室溫3 000 r/min離心15 min。將離心后的上清液移至新的離心管中,再經(jīng)16 000 r/min、室溫條件下離心10 min,將離心后的上清液移至新的離心管中,獲得血漿成分,備用。
1.2.3 檢測血漿中cfDNA含量:按照DNA提取試劑盒說明書進行操作,獲得cfDNA,并置于冰上,立即行cfDNA濃度測定。
采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組之間的差異性采用單因素方差分析進行比較。P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
檢測不同時間、不同存放溫度下各組血液標本中cfDNA的濃度,結(jié)果顯示,4 ℃下,存放2 h、6 h、24 h時,cfDNA的濃度均低于采血后立即檢測的結(jié)果,且6 h與24 h的檢測結(jié)果比較,差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05) ;25 ℃ (室溫) 下,2 h和6 h的cfDNA濃度均低于0 h的濃度,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (均P < 0.05) ,但24 h cfDNA濃度卻高于0 h,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05) 。同一時間段、不同溫度下的檢測結(jié)果顯示,2 h時差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P > 0.05) ,6 h和24 h時,則均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P < 0.05) 。見表1。
表1 不同時間和溫度下cfDNA濃度比較 (μ g/μ L)
1948年法國學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)了人類血液中存在cfDNA[1]。在多種疾病狀態(tài)下,患者的血漿中都可以檢測到cfDNA含量顯著升高,因此,認為血漿中cfDNA是一種很有前景的疾病診斷分子標志物,且具有提取樣本方便等優(yōu)點。目前,關(guān)于cfDNA的研究主要集中在產(chǎn)前診斷[2-3]、腫瘤的早期診斷與預(yù)后判斷[4-5]及感染性疾?。?-7]等領(lǐng)域。在疾病狀態(tài)或應(yīng)激條件下,cfDNA的濃度顯著升高。有學(xué)者對腫瘤患者血漿中的cfDNA進行研究發(fā)現(xiàn),它具有腫瘤細胞DNA的一些特征,因而認為腫瘤患者血漿中游離的DNA可能來源于脫落的腫瘤細胞、腫瘤的凋亡細胞和壞死細胞;另有學(xué)者[8]則認為cfDNA主要來源于活細胞,特別是增殖旺盛的細胞。血液中cfDNA的濃度升高不僅見于各種腫瘤患者、孕婦等細胞增殖旺盛的人群,各種老年性疾病,如心肌梗死、中風(fēng)等患者的血漿中cfDNA的濃度也顯著升高[9]。
由于cfDNA含量較少,提取難度大,且提取過程中存在部分丟失,存放時間長短及存放溫度等都會影響cfDNA的提取量。研究者對血液中cfDNA的正常參考值范圍進行了檢測,檢測的樣本多來自正常健康人,可能由于實驗樣本數(shù)量的差異及樣本處理和檢測方法的差異,導(dǎo)致各研究組的結(jié)果之間也存在很大的差異。ILOEJE等[10]采集了16例健康人的外周血,利用酚-氯仿法提取血漿中的cfDNA,結(jié)果顯示其含量約為 (27.6±6.91) μg/mL;KOCSIS等[11]利用QIAamp試劑盒提取外周血血漿中的cfDNA,檢測其含量平均值約為1.6 μg/mL;有研究[12-14]顯示,cfDNA的含量均<15 ng/mL。然而,由于血漿中cfDNA的提取難度較大,無論用何種方法提取都會存在一定的蛋白或多糖污染,影響DNA純度值。應(yīng)用QIAamp試劑盒所提取的血漿cfDNA的純度值OD260/OD280為1.24~1.76,也未達到1.8~2.0這一理想?yún)^(qū)間。
要利用血漿cfDNA所提供的信息來進行臨床診斷及指導(dǎo)臨床治療,必須明確cfDNA的來源及其濃度變化的機制。研究[15]認為,血漿中cfDNA的半衰期很短,獲得血液樣本后應(yīng)立即進行離心處理;而ANKER等[16]則認為,血漿中的cfDNA并非單獨存在,而是與某種組蛋白相結(jié)合,以復(fù)合物的形式存在于血漿中,因此可以耐受多種酶的降解。
本研究檢測了不同存放時間及不同存放溫度下,血漿DNA濃度的變化,結(jié)果顯示,4 ℃下存放2 h、6 h、24 h時,cfDNA的濃度均低于采血后立即檢測的結(jié)果;25 ℃ (室溫) 下存放2 h和6 h的cfDNA濃度均低于采血后立即檢測的濃度,但24 h時的濃度卻高于采血后立即檢測,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P < 0.05) 。同一時間段,不同溫度下的檢測結(jié)果顯示,2 h時,4 ℃與25 ℃檢測結(jié)果比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P >0.05) ,6 h和24 h時卻均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P < 0.05) 。分析其原因可能是由于血液存放時間過長,血液釋放降解酶,血漿中cfDNA極易被酶所降解,但存放24 h后,cfDNA濃度反而增高,也許是由于血液存放時間過長導(dǎo)致一部分血細胞破碎,破碎的血細胞可釋放出一定量的DNA,而這部分DNA可能與血漿中原來存在的cfDNA共同導(dǎo)致檢測結(jié)果升高。但這種情況下分析出來的結(jié)果可能會影響準確性及臨床相關(guān)疾病的診斷與分析。
綜上所述,不論是實驗研究還是臨床診斷,檢測cfDNA都應(yīng)盡量在獲得血液標本后立即進行分離,采血2 h內(nèi)檢測可以不考慮存放溫度的影響。不能立即檢測者則可以先分離血漿后保存在-80 ℃冰箱中備用,來抑制降解酶的活性,保證血漿中cfDNA穩(wěn)定,以防延長血液分離時間導(dǎo)致血漿cfDNA降解和細胞破碎釋放DNA,影響后續(xù)檢測結(jié)果。