李嘉，張玲 ，李妍 ，穆潤(rùn)清

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1. 門診采血中心；2. 腫瘤研究所生物治療室；3. 檢驗(yàn)科，沈陽(yáng) 110001）

早在1948年，學(xué)者M(jìn)ANDEL等［1］就報(bào)道了血漿中游離DNA （cell-free DNA，cfDNA） 的存在。由于其含量較少，且大多為小分子片段DNA［2］，提取較困難，在提取過(guò)程中常會(huì)丟失一部分DNA，導(dǎo)致檢驗(yàn)的相對(duì)靈敏度降低，影響實(shí)驗(yàn)及臨床結(jié)果的真實(shí)性，也由此限制了血漿cfDNA在臨床診斷中的應(yīng)用。最近的研究顯示，腫瘤患者血漿中cfDNA的含量顯著高于正常健康人群血漿中的含量，且檢測(cè)出的突變基因可用于指導(dǎo)腫瘤的靶向治療。關(guān)于在獲取腫瘤患者的血液樣本后，血液存放溫度和存放時(shí)間對(duì)cfDNA檢測(cè)結(jié)果是否有影響目前尚未明確。本研究擬檢測(cè)采血后不同存放時(shí)間及溫度下血漿中cfDNA的含量，并比較其提取效率，探討最佳的分離處理時(shí)間，為臨床上提高分離提取cfDNA的效率提供正確的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

DNA提取試劑盒 （QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit，德國(guó)QIAGEN公司） 、DNA濃度檢測(cè)試劑盒（中國(guó)上海晶抗生物公司） 。DNA濃度檢測(cè)儀 （Qubit，美國(guó)Invitrogen公司） 。

1.2 方法

1.2.1 采集血液標(biāo)本：血液樣本采自50例健康志愿者，其中男30例，女20例，年齡25～65歲，平均年齡43歲。抽取空腹外周靜脈血至EDTA抗凝采血管 （5 mL/管，7管/人） ，然后將其分別置于4 ℃、25 ℃，并分別存放2 h、6 h、24 h，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 提取cfDNA：取不同存放時(shí)間及存放溫度的全血樣本5 mL，室溫3 000 r/min離心15 min。將離心后的上清液移至新的離心管中，再經(jīng)16 000 r/min、室溫條件下離心10 min，將離心后的上清液移至新的離心管中，獲得血漿成分，備用。

1.2.3 檢測(cè)血漿中cfDNA含量：按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，獲得cfDNA，并置于冰上，立即行cfDNA濃度測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組之間的差異性采用單因素方差分析進(jìn)行比較。P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

檢測(cè)不同時(shí)間、不同存放溫度下各組血液標(biāo)本中cfDNA的濃度，結(jié)果顯示，4 ℃下，存放2 h、6 h、24 h時(shí)，cfDNA的濃度均低于采血后立即檢測(cè)的結(jié)果，且6 h與24 h的檢測(cè)結(jié)果比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05） ；25 ℃ （室溫） 下，2 h和6 h的cfDNA濃度均低于0 h的濃度，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P < 0.05） ，但24 h cfDNA濃度卻高于0 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05） 。同一時(shí)間段、不同溫度下的檢測(cè)結(jié)果顯示，2 h時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P > 0.05） ，6 h和24 h時(shí)，則均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05） 。見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間和溫度下cfDNA濃度比較 （μ g/μ L）

3 討論

1948年法國(guó)學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)了人類血液中存在cfDNA［1］。在多種疾病狀態(tài)下，患者的血漿中都可以檢測(cè)到cfDNA含量顯著升高，因此，認(rèn)為血漿中cfDNA是一種很有前景的疾病診斷分子標(biāo)志物，且具有提取樣本方便等優(yōu)點(diǎn)。目前，關(guān)于cfDNA的研究主要集中在產(chǎn)前診斷［2-3］、腫瘤的早期診斷與預(yù)后判斷［4-5］及感染性疾?。?-7］等領(lǐng)域。在疾病狀態(tài)或應(yīng)激條件下，cfDNA的濃度顯著升高。有學(xué)者對(duì)腫瘤患者血漿中的cfDNA進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，它具有腫瘤細(xì)胞DNA的一些特征，因而認(rèn)為腫瘤患者血漿中游離的DNA可能來(lái)源于脫落的腫瘤細(xì)胞、腫瘤的凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞；另有學(xué)者［8］則認(rèn)為cfDNA主要來(lái)源于活細(xì)胞，特別是增殖旺盛的細(xì)胞。血液中cfDNA的濃度升高不僅見(jiàn)于各種腫瘤患者、孕婦等細(xì)胞增殖旺盛的人群，各種老年性疾病，如心肌梗死、中風(fēng)等患者的血漿中cfDNA的濃度也顯著升高［9］。

由于cfDNA含量較少，提取難度大，且提取過(guò)程中存在部分丟失，存放時(shí)間長(zhǎng)短及存放溫度等都會(huì)影響cfDNA的提取量。研究者對(duì)血液中cfDNA的正常參考值范圍進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)的樣本多來(lái)自正常健康人，可能由于實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量的差異及樣本處理和檢測(cè)方法的差異，導(dǎo)致各研究組的結(jié)果之間也存在很大的差異。ILOEJE等［10］采集了16例健康人的外周血，利用酚-氯仿法提取血漿中的cfDNA，結(jié)果顯示其含量約為 （27.6±6.91） μg/mL；KOCSIS等［11］利用QIAamp試劑盒提取外周血血漿中的cfDNA，檢測(cè)其含量平均值約為1.6 μg/mL；有研究［12-14］顯示，cfDNA的含量均<15 ng/mL。然而，由于血漿中cfDNA的提取難度較大，無(wú)論用何種方法提取都會(huì)存在一定的蛋白或多糖污染，影響DNA純度值。應(yīng)用QIAamp試劑盒所提取的血漿cfDNA的純度值OD260/OD280為1.24～1.76，也未達(dá)到1.8～2.0這一理想?yún)^(qū)間。

要利用血漿cfDNA所提供的信息來(lái)進(jìn)行臨床診斷及指導(dǎo)臨床治療，必須明確cfDNA的來(lái)源及其濃度變化的機(jī)制。研究［15］認(rèn)為，血漿中cfDNA的半衰期很短，獲得血液樣本后應(yīng)立即進(jìn)行離心處理；而ANKER等［16］則認(rèn)為，血漿中的cfDNA并非單獨(dú)存在，而是與某種組蛋白相結(jié)合，以復(fù)合物的形式存在于血漿中，因此可以耐受多種酶的降解。

本研究檢測(cè)了不同存放時(shí)間及不同存放溫度下，血漿DNA濃度的變化，結(jié)果顯示，4 ℃下存放2 h、6 h、24 h時(shí)，cfDNA的濃度均低于采血后立即檢測(cè)的結(jié)果；25 ℃ （室溫） 下存放2 h和6 h的cfDNA濃度均低于采血后立即檢測(cè)的濃度，但24 h時(shí)的濃度卻高于采血后立即檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05） 。同一時(shí)間段，不同溫度下的檢測(cè)結(jié)果顯示，2 h時(shí)，4 ℃與25 ℃檢測(cè)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P >0.05） ，6 h和24 h時(shí)卻均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P < 0.05） 。分析其原因可能是由于血液存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，血液釋放降解酶，血漿中cfDNA極易被酶所降解，但存放24 h后，cfDNA濃度反而增高，也許是由于血液存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致一部分血細(xì)胞破碎，破碎的血細(xì)胞可釋放出一定量的DNA，而這部分DNA可能與血漿中原來(lái)存在的cfDNA共同導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果升高。但這種情況下分析出來(lái)的結(jié)果可能會(huì)影響準(zhǔn)確性及臨床相關(guān)疾病的診斷與分析。

綜上所述，不論是實(shí)驗(yàn)研究還是臨床診斷，檢測(cè)cfDNA都應(yīng)盡量在獲得血液標(biāo)本后立即進(jìn)行分離，采血2 h內(nèi)檢測(cè)可以不考慮存放溫度的影響。不能立即檢測(cè)者則可以先分離血漿后保存在-80 ℃冰箱中備用，來(lái)抑制降解酶的活性，保證血漿中cfDNA穩(wěn)定，以防延長(zhǎng)血液分離時(shí)間導(dǎo)致血漿cfDNA降解和細(xì)胞破碎釋放DNA，影響后續(xù)檢測(cè)結(jié)果。