何波，王文瑞，李健，王平

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110032）

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，90%以上為移行上皮細(xì)胞癌［1］。至今，膀胱癌的治療進(jìn)展緩慢。因此，迫切需要尋找有效的膀胱癌治療方法［2］。

蛋白質(zhì)的動態(tài)平衡是大多數(shù)真核細(xì)胞生長過程中必不可少的。其中，在蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)里，泛素-蛋白酶體系統(tǒng) （ubiquitin proteasome system，UPS）扮演著至關(guān)重要的作用，該系統(tǒng)降解細(xì)胞內(nèi)85%以上的蛋白質(zhì)［3］，參與多種細(xì)胞功能，與腫瘤關(guān)系密切［4-7］。近年來，以泛素-蛋白酶體系統(tǒng)作為抗癌治療靶點的研究越來越多。美國食品藥品監(jiān)督管理局陸續(xù)批準(zhǔn)使用蛋白酶體抑制劑 （硼替佐米、卡非佐米） 治療多發(fā)性骨髓瘤和其他一些血液系統(tǒng)腫瘤。事實上，蛋白酶抑制劑已經(jīng)證明了干預(yù)癌癥的治療潛力。MG132是一種常用的蛋白酶體抑制劑，文獻(xiàn)［8-11］報道，MG132可以促進(jìn)多種癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及逆轉(zhuǎn)某些惡性特征，是一種潛在的抗腫瘤藥物。本研究擬探討MG132對膀胱癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，旨在為膀胱癌尋找新的治療藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

膀胱癌細(xì)胞系 （BIU87、 T24，中科院上海生命科學(xué)研究院） ，1640培養(yǎng)基 （美國Gibco公司），F(xiàn)BS（美國Gibco公司），兔抗人caspase-3抗體、兔抗人β-Tubulin抗體、辣根過氧化物酶連接的抗兔二抗 （美國Thermo Fisher公司），CCK-8試劑盒 （日本同仁），Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 （BD 生命科學(xué)公司），MG132 （德國Calbiochem 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：2種膀胱癌細(xì)胞系由RPMI 1640完全培養(yǎng)液 （含10% FBS、1%青-鏈霉素雙抗） 在37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用 0.25% 胰酶溶液（內(nèi)含EDTA） 進(jìn)行消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 MG132處理膀胱癌細(xì)胞：首先用稀釋劑 （按DMSO與無水乙醇1∶1的比例配制而成） 將MG132溶解為一定濃度。將細(xì)胞分為培養(yǎng)液處理的MOCK組 （空白對照組）、只加稀釋劑的NC組 （陰性對照組）和實驗組。實驗組又進(jìn)一步按不同藥物終濃度、不同藥物干預(yù)時間分組。將MG132按終濃度0、1、2、3、4、6、8、10 μ mol/L，分別于0、1、2、4、8、12、24、48 h作用于BIU87膀胱癌細(xì)胞，CCK-8檢測MG132對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響，篩選出最佳藥物終濃度、最佳藥物作用時間。經(jīng)篩選，后續(xù)實驗按藥物最佳干預(yù)條件進(jìn)行。

1.2.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力：提前分好組，然后在96孔板中接種膀胱癌細(xì)胞并過夜，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時按上述MG132干預(yù)細(xì)胞的方法加入MG132。在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞適當(dāng)時間。然后更換為110 μ L （10 μ L CCK-8原液+100 μ L培養(yǎng)基） 含CCK-8的RPMI1640培養(yǎng)基，放入恒溫孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h；用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：按實驗分組，提前1 d接種膀胱癌細(xì)胞于6孔板中，按藥物最佳干預(yù)條件給予MG132處理。細(xì)胞孵育適當(dāng)時間后，用不含EDTA的胰酶消化收集貼壁細(xì)胞。用預(yù)冷 （4 ℃） PBS沖洗重懸細(xì)胞2次，室溫1 000 r/min離心3 min，收集細(xì)胞沉淀。加入300 μ L的1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μ L Annexin V-FITC混勻后，避光室溫孵育15 min。上機(jī)前5 min加入5 μ L的PI染色進(jìn)行標(biāo)記。上機(jī)前補(bǔ)加200 μ L的1×結(jié)合緩沖液。最后上機(jī)進(jìn)行檢測。

1.2.5 Western blotting：MG132處理膀胱癌細(xì)胞后，提取細(xì)胞蛋白，用BCA 法檢測總蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白濃度并加以調(diào)整和處理。蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，120 V恒壓電泳，電泳時間約2～3 h。110 mA恒流90 min轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完畢后，觀察marker條帶是否清晰來判斷是否轉(zhuǎn)膜成功。用3% BSA室溫封閉1～2 h，封閉后用TBST沖洗1次，5 min。然后行抗體孵育，一抗4 ℃孵育過夜 （或室溫4 h），TBST洗滌3次，二抗室溫孵育1～2 h，TBST洗滌3次。ECL發(fā)光，采用Image J軟件行結(jié)果分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖均采用 SPSS 20.0 軟件、Graphpad prism 6.0，組間均數(shù)比較采用t檢驗，2組以上數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MG132對膀胱癌細(xì)胞增殖活力的影響

用不同終濃度及不同處理時間的MG132干預(yù)BIU87膀胱癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，在24 h與48 h生長曲線上，陰性對照組與空白對照組的OD450值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P > 0.05）。表明MG132的稀釋劑對BIU87膀胱癌細(xì)胞增殖活力無明顯影響。且在相同處理時間下，與空白對照組比較，隨著MG132濃度的增加，BIU87膀胱癌細(xì)胞增殖活力逐漸減低，即MG132對其細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P < 0.05），結(jié)果呈現(xiàn)出濃度依賴性的關(guān)系，即當(dāng)濃度為≤2 μ mol/L，對細(xì)胞增殖的抑制作用的濃度曲線趨勢較陡。當(dāng)濃度>2 μ mol/L時，對細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸趨于平穩(wěn)。在相同濃度處理條件下，MG132處理時間48 h對細(xì)胞增殖的抑制作用明顯高于MG132處理時間24 h （P < 0.05）。經(jīng)濃度篩選，選取2 μ mol/L為MG132藥物處理濃度。在MG132藥物處理濃度為2 μ mol/L的條件下，隨著藥物作用時間的增加，對BIU87及T24膀胱癌細(xì)胞增殖活力的抑制作用逐漸增強(qiáng) （P < 0.05），結(jié)果呈現(xiàn)出時間依賴性關(guān)系。當(dāng)處理時間≤24 h，對細(xì)胞增殖的抑制作用的濃度曲線趨勢較陡。當(dāng)處理時間>24 h，對細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸趨于平穩(wěn)。故后續(xù)實驗選取24 h為MG132藥物處理時間。見圖1。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

圖1 MG132對BIU87及T24膀胱癌細(xì)胞增殖活力的影響Fig.1 Effects of MG132 on cell proliferation of BIU87 and T24 bladder cancer cells

選取藥物終濃度2 μ mol/L 、處理時間24 h為最佳藥物干預(yù)條件，處理BIU87及T24 2種膀胱癌細(xì)胞。BIU87與T24膀胱癌細(xì)胞對照組的細(xì)胞總凋亡率分別為7.30%±0.36%和11.65%±0.050%，實驗組的細(xì)胞總凋亡率分別20.23%±0.60%和27.95%±0.55%。2種膀胱癌細(xì)胞實驗組與對照組比較，細(xì)胞總凋亡率均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P < 0.05）。見圖2。

圖2 MG132對膀胱癌細(xì)胞總凋亡率的影響Fig.2 The effect of MG132 on apoptosis rate of bladder cancer cells

2.3 Western blotting檢測MG132對caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

以最佳藥物干預(yù)條件處理BIU87及T24 2種膀胱癌細(xì)胞后，Western blotting檢測活化caspase-3（cleaved caspase-3） 蛋白表達(dá)，定量分析結(jié)果顯示，BIU87與T24膀胱癌細(xì)胞對照組cleaved caspase-3蛋白相對表達(dá)量分別為0.27±0.03和0.24±0.01，實驗組cleaved caspase-3蛋白相對表達(dá)量分別為0.75±0.01和0.92±0.01。2種膀胱癌細(xì)胞實驗組與對照組比較，實驗組cleaved caspase-3蛋白相對表達(dá)量明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P < 0.05）。見圖3。

3 討論

圖3 Cleaved caspase-3 蛋白的相對表達(dá)量Fig.3 The relative expression of cleaved caspase-3

膀胱癌是世界上第五大常見癌癥，同時也是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤［1，12］。超過80%的膀胱癌為非肌層浸潤性膀胱癌，其余約20%為肌層浸潤性膀胱癌或轉(zhuǎn)移性膀胱癌，非肌層浸潤性膀胱癌5年生存率約94%，肌層浸潤性膀胱癌的5年生存率約50%，而轉(zhuǎn)移性膀胱癌5年生存率則下降到20%以下［13］。早期發(fā)現(xiàn)膀胱癌對于改善患者的預(yù)后和總體存活率至關(guān)重要。同時，膀胱癌治療的進(jìn)展也很緩慢。因此，膀胱癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及新的治療方法仍是目前研究的重點。

研究［9，14］表明，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與了細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、蛋白質(zhì)折疊等多種細(xì)胞功能，與腫瘤、神經(jīng)變性性疾病等疾病關(guān)系密切，該系統(tǒng)為癌癥治療提供了新的治療靶點。研究［15-16］顯示，使用蛋白酶體抑制劑可促進(jìn)多種癌細(xì)胞的凋亡，如蛋白酶體抑制劑硼替佐米用于治療多發(fā)性骨髓瘤患者、套細(xì)胞淋巴瘤，已成為蛋白酶體抑制劑用于抗腫瘤治療的先例，二代抑制劑目前正處于臨床研發(fā)階段。MG132是一種常用的蛋白酶體抑制劑，有文獻(xiàn)報道MG132可以誘導(dǎo)骨肉瘤［9］、甲狀腺癌［8］、前列腺癌［17］、肺癌［18-19］、膽囊癌［20］等多種腫瘤細(xì)胞凋亡，是一種潛在的抗腫瘤藥物。本研究運(yùn)用CCK8及流式細(xì)胞術(shù)檢測MG132對BIU87及T24 2種膀胱癌細(xì)胞的增殖活力和凋亡的影響，同時篩選出最佳藥物終濃度、最佳藥物作用時間。結(jié)果顯示，MG132可以明顯抑制膀胱癌細(xì)胞增殖活力及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性。本研究還應(yīng)用Western blotting定量檢測分析了MG132對凋亡相關(guān)蛋白caspase-3活性的影響。caspase家族在細(xì)胞凋亡的過程中起著十分重要的作用，其中，caspase-3是關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者，正常條件下，caspase-3以酶原的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，在多種凋亡信號刺激下，它被激活為cleaved caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［19，21］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比較，2種膀胱癌細(xì)胞實驗組的cleaved caspase-3蛋白相對表達(dá)量明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P < 0.05）。

綜上所述，蛋白酶體抑制劑MG132可以明顯抑制膀胱癌細(xì)胞增殖活力，并呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性，同時也可以誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡。