劉淑娟 楊愛紅 周華 劉騰云 李彥強(qiáng) 鐘永達(dá) 余發(fā)新
摘要[目的]研究樟樹的開花及傳粉生物學(xué)特性。[方法]測(cè)量花部綜合特征,MTT法測(cè)花粉活性,聯(lián)苯胺-過氧化氫法測(cè)柱頭的可授性,通過異交指數(shù)、花粉胚珠比和人工授粉試驗(yàn)測(cè)定樟樹的繁育系統(tǒng)類型,通過訪花觀察確定樟樹的主要傳粉者類型。[結(jié)果]樟樹的花較小,柱頭-花藥間存在一定的空間分離;樟樹的單花期3~4d,花粉的高活性可以持續(xù)到花開后的第3天,而柱頭具有較高的可授性是在花開的前2d;樟樹的繁育系統(tǒng)為兼性異交,自交親和,需要傳粉者,且樟樹的結(jié)實(shí)率受到傳粉者不足的限制,導(dǎo)致其自然結(jié)實(shí)率偏低,只有36.7%。[結(jié)論]該研究可為深入開展樟樹的種質(zhì)資源保存、雜交育種以及良種選育等工作奠定基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞樟樹;傳粉生物學(xué);繁育系統(tǒng);結(jié)實(shí)率;花粉活性;柱頭可授性
中圖分類號(hào)S718.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A
文章編號(hào)0517-6611(2019)01-0111-04
doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.034
開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID):
樟樹(Cinnamomumcamphora)又名樟木、芳樟、小葉樟、烏樟等,是生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶地區(qū)的優(yōu)勢(shì)多用途樹種,與楠、梓、桐合稱為“江南四大名木”,為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[1]。樟樹在我國(guó)既是珍貴的盛產(chǎn)芳香油類的經(jīng)濟(jì)林樹種,又是水源涵養(yǎng)、河堤防護(hù)的重要防護(hù)林樹種,還是優(yōu)質(zhì)的園林綠化樹種,具有重要的經(jīng)濟(jì)和園藝價(jià)值,廣泛分布于北亞熱帶以南地區(qū)。野生樟樹主要分布于秦嶺、長(zhǎng)江流域以南各省區(qū),多分布于海拔300~1000m的低山丘陵地區(qū);人工培育的樟樹林分布更為廣泛,多栽培在海拔200m以下的丘陵、山地與平原等地區(qū)。樟樹性喜溫暖濕潤(rùn)的氣候,耐濕熱、抗高溫,能夠適應(yīng)40℃的高溫氣候;但不耐寒,因此一般適合種植在年平均氣溫16℃以上的亞熱帶以南地區(qū)[2-3]。樟樹的典型特征為樹形高大美觀(可達(dá)30~40m)、冠幅大、壽命長(zhǎng)(成為古樹,壽命長(zhǎng)達(dá)1000年以上)。樟樹木材致密美觀且切面光滑,自有一股獨(dú)特的芳香味,還可以防腐防蛀,因而被稱為“香樟”,廣泛用于制作家具、手工藝品以及供建筑、造船之用[4-5];樟樹是重要的行道樹和園林綠化樹種,病蟲害少,適宜栽種,在我國(guó)長(zhǎng)江流域及以南地區(qū)被廣泛種植在居民小區(qū)、公園、道路兩側(cè)等。然而其結(jié)籽量大,落籽持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),影響了地面的整潔與美觀,給環(huán)衛(wèi)工作者帶來(lái)了不小的工作,若能通過雜交育種選育出不結(jié)籽或結(jié)籽量小的樟樹新品種,將會(huì)大大提高樟樹的景觀利用價(jià)值。
此外,隨著天然林禁伐政策的實(shí)施,我國(guó)優(yōu)質(zhì)用材樹種供求矛盾日益突出,尤其是珍貴闊葉材,其來(lái)源幾近枯竭。樟樹是熱帶亞熱帶常綠闊葉林的重要組成樹種之一,其高質(zhì)量人工林的培育和開發(fā)利用對(duì)于緩解用材需求、滿足人們用材需求、保護(hù)環(huán)境等具有重要的作用。然而,當(dāng)前樟樹的良種化水平低,尤其是材用樟樹的遺傳改良還沒有真正起步,現(xiàn)有樟樹通常存在生長(zhǎng)速度慢、干形差、出材率低等問題,嚴(yán)重影響了其利用價(jià)值[6],如果能夠通過雜交育種等措施選育出生長(zhǎng)快、干形直、材質(zhì)好的優(yōu)良品種,將會(huì)極大地促進(jìn)工業(yè)原料林的發(fā)展以及樹種、林種結(jié)構(gòu)的調(diào)整,提高森林質(zhì)量。種種需求表明,開展樟樹雜交育種工作是樟樹優(yōu)良品種選育的重要途徑。現(xiàn)有對(duì)樟屬植物的研究還主要集中在生物學(xué)特性[7]、栽培和移植技術(shù)[8-9]、苗期的遺傳變異[10-11]、精油成分[12-13]、精油提取方法[13-15]、抗干旱及低溫脅迫[16-18]等方面,其雜交育種工作尚未起步。了解植物的繁育機(jī)理和交配系統(tǒng)類型是進(jìn)行雜交育種和良種選育工作的前提,目前樟樹在這方面的研究還少之又少,這將嚴(yán)重阻礙其雜交育種及良種選育工作的開展,因此,對(duì)樟樹的繁育系統(tǒng)、交配模式及傳粉過程等進(jìn)行系統(tǒng)性的基礎(chǔ)性研究勢(shì)在必行。筆者通過對(duì)樟樹花粉及柱頭活性、繁育系統(tǒng)、交配模式、傳粉過程等進(jìn)行研究,揭示樟樹的繁育系統(tǒng)特性,旨在為今后深入開展樟樹的種質(zhì)資源保存、雜交育種以及良種選育等工作奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
以分布于江西省科學(xué)院院內(nèi)、南昌大學(xué)校內(nèi)以及艾溪湖濕地公園等試驗(yàn)點(diǎn)的樟樹為材料,試驗(yàn)開展時(shí)間為2017、2018年的4—5月。樟樹的開花期為每年的4—5月,持續(xù)約30d,花小而多(圖1A),花藥2輪,內(nèi)輪3個(gè)為敗育雄蕊,外輪6個(gè)花藥為可育雄蕊,柱頭1個(gè),位于2輪雄蕊的中間(圖1B),單花花期3~4d(圖1C)。果實(shí)球形,成熟后為黑紫色,直徑約0.5cm,果實(shí)成熟期在10—11月。
1.2方法
1.2.1繁育系統(tǒng)。
1.2.1.1異交指數(shù)(outcrossingindex,OCI)的估算。測(cè)量花部綜合特征,包括花朵直徑、花藥開裂時(shí)間與柱頭可授期的時(shí)間間隔、柱頭與花藥的空間位置,按照Dafni[19]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行繁育系統(tǒng)的描述。
1.2.1.2花粉胚珠比(pollenovuleratio,P/O)的估算。隨機(jī)采摘即將散粉的花蕾狀態(tài)的花15朵,用70%乙醇固定于離心管中并帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室,將整朵花放在小研缽中充分研碎,在5mL容量瓶中稀釋定容,充分振蕩搖勻,用移液槍隨機(jī)吸取5滴(每滴50μL)滴于載玻片上,在NikonE100顯微鏡100×倍數(shù)下數(shù)花粉的數(shù)量,取5滴的平均值乘以稀釋倍數(shù)100,即為該花的花粉產(chǎn)量[19-20]。將子房放在體視顯微鏡下解剖,并將胚珠均勻散開,統(tǒng)計(jì)胚珠數(shù)量。
47卷1期劉淑娟等樟樹的開花特性及傳粉生物學(xué)研究
1.2.1.3花粉活力與柱頭可授性。花粉活力測(cè)定采用MTT染色法[21-23],事先將樟樹花苞套袋,花開一小口(針孔大小)即開始散粉,將此狀態(tài)視為開花第1天,分別選取開花第1、2、3、4天的花各10朵,帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)花粉活性。首先滴1~2滴MTT溶液在載玻片上,然后剝掉花瓣,手持花梗將花藥部分在MTT滴液里來(lái)回蹭幾次,蓋上蓋玻片。10min后在低倍鏡下觀察,選取5個(gè)視野,每個(gè)視野花粉數(shù)在30粒以上,取其平均值作為花粉活力指標(biāo)。凡是染成深紅色甚至紫黑色的花粉,其生活力為強(qiáng)(圖1D),紅色的次之,無(wú)色的為不具活力的花粉或不育花粉?;ǚ刍盍?某視野變色的花粉粒數(shù)目/該視野花粉粒總數(shù)×100%。
柱頭可授性測(cè)定采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法[23]:隨機(jī)選擇處于開花前1d、開花第1天,第1、2、3、4天的花各10朵,將柱頭取下浸入凹面載玻片含有聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液(1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22,體積比)的凹陷處。若柱頭具可授性,則柱頭周圍呈現(xiàn)藍(lán)色并有大量氣泡出現(xiàn)。根據(jù)藍(lán)色深淺和氣泡多少表示可授性強(qiáng)弱。
1.2.1.4套袋及人工授粉試驗(yàn)。在盛花期分別選取花苞狀態(tài)的花進(jìn)行套袋處理,待袋內(nèi)的花苞開放后再進(jìn)行人工授粉處理:①套袋人工輔助自花,取自花或同株異花的花粉作為花粉供體,授在柱頭上,然后套袋直至花凋謝;②套袋人工輔助異花,將花苞狀態(tài)的花套袋,待花開放后,選擇另一試驗(yàn)點(diǎn)的植株作為花粉源將花粉授到柱頭上,套袋直至花凋謝;③套袋自動(dòng)自花處理,一直套袋直至花凋謝;④對(duì)照處理,自然狀態(tài),不去雄,不套袋,使其自然授粉。一個(gè)植株內(nèi)不同處理用不同顏色的尼龍線標(biāo)記。整個(gè)授粉處理植株內(nèi),同一種處理用同一種顏色的尼龍線標(biāo)記。
1.2.2
訪花昆蟲的觀察。盛花期分別在3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)隨機(jī)選取樟樹1枝,統(tǒng)計(jì)正在開放的花數(shù),以30min為一個(gè)時(shí)間段,從9:00—17:00記錄來(lái)訪昆蟲的種類、訪花數(shù)量、訪花行為及訪問單花的時(shí)間,總觀察時(shí)間大于30h。
1.2.3數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析、做圖均采用SPSS19.0軟件,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,N代表樣本量。
2結(jié)果與分析
2.1繁育系統(tǒng)
2.1.1異交指數(shù)(OCI)。按照Dafni[19]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行花序直徑、花朵大小和開花行為的測(cè)量及繁育系統(tǒng)的評(píng)判,具體方法:①花朵或花序直徑<1mm記為0,1~2mm記為1,2~6mm記為2,>6mm記為3;②花藥開裂時(shí)間與柱頭可授期的時(shí)間間隔,同時(shí)或雌蕊先熟記為0,雄蕊先熟記為1;③柱頭與花藥的空間位置,同一高度記為0,空間分離記為1,三者之和為OCI值。
評(píng)判標(biāo)準(zhǔn):OCI為0時(shí),繁育系統(tǒng)為閉花受精;OCI=1時(shí),繁育系統(tǒng)為專性自交;OCI為2時(shí),繁育系統(tǒng)為兼性自交;OCI為3時(shí),繁育系統(tǒng)為自交親和,有時(shí)需要傳粉者;OCI為4時(shí),繁育系統(tǒng)為部分自交親和,異交,需要傳粉者。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn),樟樹的開花直徑為(4.98±0.51)mm,記為2;柱頭和花藥幾乎同時(shí)成熟或雌蕊先熟,記為0;柱頭和花藥間有分離,記為1。樟樹的OCI得分為3,其繁育系統(tǒng)為自交親和,需要傳粉者。
2.1.2花粉胚珠比(P/O)。樟樹的平均花粉產(chǎn)量是2047,而胚珠數(shù)為1,因此其花粉胚珠比為2047,根據(jù)Cruden[24]的標(biāo)準(zhǔn):P/O為2.7~5.4時(shí),其繁育系統(tǒng)為閉花受精;P/O為18.1~39.0時(shí),繁育系統(tǒng)為專性自交;P/O為31.9~396.0時(shí),繁育系統(tǒng)為兼性自交;P/O為244.7~2588.0時(shí),繁育系統(tǒng)為兼性異交;P/O為2108.0~195525.0時(shí),繁育系統(tǒng)為專性異交。樟樹的P/O為2047,據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)可判斷其繁育系統(tǒng)為兼性異交。
2.1.3花粉活力與柱頭可授性。樟樹花在剛開一小孔時(shí)花藥已散粉,且花粉具有較高活性,花粉高活性一直持續(xù)到花開第3天,第4天開始,花開始萎蔫,花藥和柱頭均開始變黑,花粉活力明顯降低(圖2)。柱頭在開花第1天,即花剛開一小孔時(shí),具有較強(qiáng)的可授性(++),之后的第2(+)、3(+/-)天,柱頭的可授性逐漸減弱,到第4天完全失活,柱頭沒有可授性(-)。
2.1.4套袋及人工授粉試驗(yàn)。套袋試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),4種處理下的樟樹均能結(jié)實(shí)。其中,經(jīng)人工異交授粉處理的結(jié)實(shí)率與結(jié)籽率均顯著高于其他處理(表1)。無(wú)論是套袋自動(dòng)自花授粉還是人工輔助自花授粉,樟樹都可以結(jié)實(shí),說(shuō)明樟樹具有一定的自交親和性;而套袋后人工輔助異花授粉可以明顯提高樟樹的結(jié)實(shí)率,說(shuō)明自然條件下,樟樹存在異源花粉限制。綜上所述,樟樹的繁育系統(tǒng)為兼性異交,自交親和。
2.2訪花昆蟲的觀察
訪花觀察發(fā)現(xiàn),樟樹的主要傳粉昆蟲是食蚜蠅(Syrphidae,圖1E),其次是蜜蜂(Apismellifera,圖1F),偶爾見到蠅類訪問。食蚜蠅的訪花時(shí)間從09:00開始,隨著溫度升高,活動(dòng)量也逐漸加大,至15:00—16:00,訪花的食蚜蠅最多,活動(dòng)量也達(dá)到最大。食蚜蠅在訪問樟樹時(shí),會(huì)在同一株上連續(xù)訪問十幾至二十朵花,平均每小時(shí)每花的被訪問次數(shù)為0.016次,每朵花的平均停留時(shí)間為2~3s。蜜蜂的訪花高峰期在10:00—12:00,下午相對(duì)較少,總體訪花頻率也較低,平均每小時(shí)訪花數(shù)為0.012,每朵花的停留時(shí)間為1~2s。蠅類的訪花頻率最低,偶爾可見1只,一次訪問1~2朵花。
3結(jié)論與討論
3.1樟樹的開花特性與傳粉適應(yīng)樟樹的花在開放第1天,即剛剛裂開一小孔時(shí),花藥即開始散粉且花粉具有較高的活性(大于97%),此時(shí)的柱頭同樣具有較強(qiáng)的可授性,但由于這個(gè)時(shí)候柱頭花藥間存在一定距離,柱頭位于花藥的下方,即柱頭花藥間在空間上有一定隔離,這大大降低了自動(dòng)自花授粉的可能性[25]。隨著開花天數(shù)的推移,花粉持續(xù)保持較高活性(90%以上),但柱頭具有較強(qiáng)可授性僅持續(xù)2d,到了第3天,柱頭活性減弱,柱頭-花藥間的空間分離也逐漸縮小??梢?,開花前期柱頭花藥空間結(jié)構(gòu)上的分離是一種避免自花授粉的機(jī)制[26]。
然而,樟樹輔助自花授粉的結(jié)實(shí)率跟自然授粉的結(jié)果相似,推測(cè)自然狀態(tài)下樟樹的座果在很大程度上來(lái)自同株異化授粉,這主要依據(jù)野外訪花觀察結(jié)果。樟樹單株的開花量巨大,其主要訪花者食蚜蠅或蜜蜂會(huì)在同一棵樟樹上連續(xù)訪花10朵以上,這樣就會(huì)限制花粉的來(lái)源,造成同株異花授粉。此外,樟樹的開花期恰值陰雨季節(jié),溫度較低,陰、雨等惡劣天氣不僅影響昆蟲訪花頻率,也影響花粉及柱頭的生活力[27]。氣象因素還影響生境內(nèi)的昆蟲區(qū)系,進(jìn)而影響樟樹訪花者的種類和數(shù)量[28]。樟樹的傳粉昆蟲種類單一,主要是食蚜蠅或蜜蜂,訪問頻率均較低,且食蚜蠅傳粉效率低,而樟樹的柱頭可授期短(2d),因此受天氣的影響嚴(yán)重,最終影響到樟樹的結(jié)實(shí)率,導(dǎo)致跟其開花量相比,樟樹的自然結(jié)實(shí)率較低,為36.7%。
3.2樟樹繁育系統(tǒng)類型的判定
根據(jù)Dafni[19]的標(biāo)準(zhǔn)和Gruden[24]的標(biāo)準(zhǔn)可知,兩指標(biāo)的結(jié)果基本一致,樟樹的繁育系統(tǒng)是兼性異交,自交親和,這和人工授粉及訪花觀察的結(jié)果也是一致的。OCI檢測(cè)是從植物形態(tài)適應(yīng)蟲媒傳粉出發(fā),相對(duì)于P/O準(zhǔn)確性更高[29]。而人工控制授粉試驗(yàn)則排除了環(huán)境因素和授粉過程的差異,直接關(guān)注柱頭和花粉識(shí)別對(duì)結(jié)實(shí)率的影響,為3種方法中最為有效的檢測(cè)方式[30]。從不同來(lái)源花粉授粉的結(jié)果看,輔助自花授粉處理的結(jié)實(shí)率明顯低于輔助異株異花授粉處理,可見樟樹存在一定的近交衰退,而自然授粉的平均結(jié)實(shí)率與異株異花授粉處理之間的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果差異顯著,說(shuō)明樟樹自然條件下的有性繁殖系統(tǒng)受到花粉限制和缺少傳粉昆蟲的影響[31-32]。該研究綜合3種測(cè)定方法的結(jié)果,判定樟樹為兼性異交,自交親和,需要傳粉者(該結(jié)果和Shivaprasad等[33]對(duì)樟屬C.sulphuratum的研究結(jié)果一致),且結(jié)實(shí)率受到傳粉者不足的限制。后續(xù)試驗(yàn)將會(huì)對(duì)樟樹不同授粉處理的種子萌發(fā)情況及萌發(fā)規(guī)律做進(jìn)一步研究,從種子萌發(fā)層面判定樟樹的近交衰退水平及繁育系統(tǒng)類型。
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