李娜 陳勝 程書鋒 祃志明 彭建

摘要[目的]有效預(yù)防和控制恩施種植區(qū)域煙草黑脛病害。[方法]通過(guò)表面消毒分離、平板共培養(yǎng)、分子生物學(xué)鑒定、室內(nèi)盆栽方法篩選、鑒定及評(píng)價(jià)菌株抑制活性。[結(jié)果]從恩施健康煙草植株中分離篩選出一株對(duì)煙草黑脛病病原菌有顯著拮抗活性的菌株XA-1，該菌株的胞外分泌物對(duì)病原菌菌絲有強(qiáng)烈的抑制作用，通過(guò)Biolog微生物系統(tǒng)和分子生物學(xué)分析，初步鑒定該菌株屬于解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliauefaciens），經(jīng)室內(nèi)盆栽試驗(yàn)評(píng)價(jià)，拮抗菌XA-1能有效地降低煙草黑脛病的病情指數(shù)，在第20天時(shí)相對(duì)防效最高為52.38%。[結(jié)論]菌株XA-1在防治煙草黑脛病方面效果明顯，具有潛在的生物防治應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞煙草黑脛病;生物防治;解淀粉芽孢桿菌

中圖分類號(hào)S435.72文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）01-0123-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.038

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

由煙草疫霉變種（PhytophoranicotianaBredadeHaan）引起的煙草黑脛病給煙草種植帶來(lái)毀滅性破壞，病害植株生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重的甚至全株死亡[1-2]。煙草黑脛病作為一種土傳病害，到目前為止尚無(wú)行之有效的防治措施，煙草黑脛病在種植上采取綜合防治措施，包括種植抗病品種、農(nóng)業(yè)防治、病害發(fā)生期的藥劑防治，以及生物防治和植物誘導(dǎo)抗性的利用等。目前，煙草種植上用來(lái)防治煙草黑脛病的化學(xué)藥劑多為甲霜靈、乙磷鋁等殺菌劑，長(zhǎng)期重復(fù)使用使煙草黑脛病菌產(chǎn)生了一定的抗藥性[3]，而且會(huì)造成一定農(nóng)藥殘留。

近年來(lái)，煙草及煙草制品逐漸向安全化方向發(fā)展，對(duì)煙草質(zhì)量的要求越來(lái)越高，因而，發(fā)展安全性高的拮抗微生物來(lái)防治煙草病害非常迫切。拮抗細(xì)菌在植物土傳病害防治中起到非常重要的作用，其主要優(yōu)勢(shì)：細(xì)菌對(duì)病原菌的作用方式較廣，可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、拮抗以及寄生、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等方式對(duì)病原菌產(chǎn)生影響;細(xì)菌的種類和數(shù)量眾多，在植物根際和周圍土壤大量存在;細(xì)菌繁殖速度非常快;許多細(xì)菌存在于植物根際和地上部，對(duì)植物生態(tài)比較適宜;細(xì)菌大多可以人工培養(yǎng)，便于控制，在實(shí)踐中易于操作;有些細(xì)菌不僅能防治病害而且可以增加作物產(chǎn)量。國(guó)內(nèi)外研究者已從各種樣品中篩選出多種對(duì)煙草黑脛病具有良好拮抗效果的生防菌株，為煙草黑脛病的生物防治提供了豐富的種質(zhì)資源[4-6]。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的生防菌主要有芽孢桿菌（Bacillusspp.）、假單孢菌（Pseudomonasspp.）和放線菌。Fravel等[7]報(bào)道過(guò)一株B.cereussubsp，在煙草幼苗生物測(cè)定試驗(yàn)中能抑制黑脛病菌游動(dòng)孢子對(duì)煙草幼苗的侵染。筆者主要針對(duì)恩施煙草種植區(qū)域的病害防治，從煙草黑脛病發(fā)病田塊選取健康植株，采用表面消毒殺菌法從其根系中分離和篩選高效拮抗菌株，從中篩選效果最好的一個(gè)菌株進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)鑒定，研究該拮抗菌株的分類地位、生物學(xué)特性和抗菌活性物質(zhì)。同時(shí)以微生物有機(jī)肥為載體，通過(guò)室內(nèi)盆栽試驗(yàn)考察拮抗菌對(duì)煙草黑脛病的控制作用，旨在為開(kāi)發(fā)土壤微生物資源、減少化學(xué)農(nóng)藥使用、發(fā)展基于有機(jī)肥的土傳病害生物防治技術(shù)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

煙草疫霉變種（Phytophthoravar.nicotianae）;白肋煙B21（感黑脛病品種，湖北省煙草科研所提供）;NB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，氯化鈉10.0g/L，蒸餾水1000mL，滅菌前pH7.2～7.4。燕麥片30.0g/L，跡量鹽1mL（FeSO40.1g，MnCl20.1g，ZnSO40.1g，蒸餾水100mL），瓊脂粉18.0g/L，蒸餾水1000mL，滅菌前pH7.2。Waksman培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化鈉5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，瓊脂18.0g/L，pH6.8。盆栽器具（均購(gòu)自武漢市花卉市場(chǎng)）：花卉培養(yǎng)土，富含N、P、K和微量元素，pH5.6～6.0;育苗穴盤和花盆等。

1.2方法

1.2.1拮抗菌株分離與篩選。

分別從恩施咸豐縣、盛家壩和下云壩等煙草黑脛病高發(fā)田塊選擇健康煙株取樣，樣品分為兩類收集：①病害嚴(yán)重田塊的健康植株;②相鄰不發(fā)病田塊的健康植株。樣品編號(hào)后放置5℃冰箱保存?zhèn)溆谩煾米詠?lái)水沖洗干凈后，稱取10g置于無(wú)菌平皿中，加入75%乙醇浸泡1min后，再轉(zhuǎn)入1%次氯酸鈉溶液中浸泡10min，處理后用無(wú)菌水漂洗3～5次，表面消毒后的煙根用滅菌解剖剪剪成約0.5mm的片段，將根片段加入到90mL裝有玻璃珠的無(wú)菌生理鹽水中，150r/min振蕩30min，取出上清液分別稀釋至10-3、10-4、10-5，移取100μL涂布于Waksman平板上。此外再移取最后一次漂洗的無(wú)菌水100μL涂布于平板上，作為檢驗(yàn)表面消毒是否徹底的參照[8]。所有分離平板在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48h，根據(jù)不同菌落形態(tài)特征挑取單菌落，然后轉(zhuǎn)接至Waksman斜面上保存。

平板共培養(yǎng)初篩[9]：煙草疫霉變種在CA平板上活化后，用0.5mm的打孔器從菌落邊緣取下新鮮菌餅，接入Waksman平板中心做指示菌，用接種環(huán)挑取分離純培養(yǎng)物在距離菌餅3cm處接種，每個(gè)菌株做3次重復(fù)，以僅接種病原真菌菌塊而未接種測(cè)試菌的作為對(duì)照。所有測(cè)試菌株放置在30℃培養(yǎng)約7d，對(duì)照平板菌落長(zhǎng)滿后，測(cè)量對(duì)照病原菌菌落直徑（R1）及與拮抗菌對(duì)峙的煙草疫霉直徑（R2），按照以下公式計(jì)算抑菌直徑和抑菌率。

抑菌直徑=R1-R2，抑菌率=（R1-R2）/R1×100%

復(fù)篩：將初篩拮抗效果好的菌株接種至裝有30mL液體NB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在30℃恒溫和轉(zhuǎn)速180r/min的回轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)72h，培養(yǎng)物在10000r/min條件下常溫離心5min，離心后除去沉淀收集上清液，上清液用無(wú)菌過(guò)濾器（0.22μm孔徑的濾膜）過(guò)濾除菌備用，在平板中心接種指示菌，并在距離指示菌3cm處打孔添加25μL發(fā)酵上清液，每個(gè)3次重復(fù)，以不添加濾液的CA平板作為對(duì)照。然后放置30℃培養(yǎng)箱中約7d后測(cè)量菌落直徑并計(jì)算抑菌率[10]。

1.2.2Biolog微生物系統(tǒng)和16SrDNA分子生物學(xué)鑒定。

待測(cè)菌株經(jīng)芽胞染色和革蘭氏染色后，確定菌株類型和合適培養(yǎng)基。從菌株保存斜面挑取菌落在BUY培養(yǎng)基平板劃線，平板放置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。用滅菌棉簽挑取已經(jīng)培養(yǎng)好的菌落，在無(wú)菌狀態(tài)下接種至濁度管中。用空白調(diào)至100%，用標(biāo)準(zhǔn)液管調(diào)至指定刻度。再用接種后的濁度管進(jìn)行測(cè)量，用無(wú)菌水不斷調(diào)整濁度的大小，達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)濁度值。將制備好的菌懸液倒人加樣槽中，使用八道電動(dòng)移液器，將其接種于微平板的96孔中。微平板在28℃生化培養(yǎng)箱中，在培養(yǎng)第6天和第1天后，將微平板放入讀數(shù)儀測(cè)定反應(yīng)結(jié)果，根據(jù)Microlog軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

提取菌株基因組DNA為模板，以上游引物GACGAGTGGCGGACGGGTG（27F）和下游引物CCATGGTGTGACGGGCGGTGTG（1492R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。純化后的產(chǎn)物測(cè)序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司的ABI3730XL自動(dòng)測(cè)序儀完成。得到菌株的16SrDNA基因測(cè)序結(jié)果后，用NCBI的Blast軟件進(jìn)行序列相似性分析，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)和核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)選取相近種屬代表性菌株的16SrDNA基因序列，通過(guò)Clustal1.8和MEGA4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用鄰接法（Neighborjoining）構(gòu)建16SrDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用于檢驗(yàn)自舉支持率（Bootstrap）的重復(fù)抽樣次數(shù)為1000次[11]。

1.2.3室內(nèi)盆栽試驗(yàn)。

煙草疫霉變種在CA平板上培養(yǎng)7d后加入0.1%KNO3溶液浸泡，在5℃低溫冰箱放置30min后加入10mL1%的葡萄糖，收集孢子液后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子濃度調(diào)為105CFU/mL備用[12]。取拮抗菌發(fā)酵液1L，離心（轉(zhuǎn)速為6000r/min）除去上清液，測(cè)定芽孢單位含量（CFU/g），然后按一定比例與麩皮混合均勻，調(diào)整菌劑芽孢含量為107CFU/g。白肋煙B21種子經(jīng)表面消毒后催芽、播種，培養(yǎng)至第10片真葉展開(kāi)，移至盆缽，盆缽置于溫室中，溫室條件為溫度25℃～30℃、濕度70%～80%、16h/d光照（日光燈，800lx）。溫室盆栽試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理：①空白對(duì)照（不接種）;②接種病原菌;③接種拮抗菌XA-1，48h后接種病原菌;④接種拮抗菌XS-2，48h后接種病原菌。每個(gè)處理30株煙。以株為單位分級(jí)調(diào)查，煙草黑脛病病情指數(shù)分為5個(gè)等級(jí)：0級(jí)，全株無(wú)病;1級(jí)，莖部病斑不超過(guò)莖圍的1/3，或1/3以下葉片凋萎;3級(jí)，莖部病斑環(huán)繞莖圍1/3～1/2，或1/3～1/2葉片輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑;5級(jí)，莖部病斑超過(guò)莖圍的1/2，但未全部環(huán)繞莖圍，或1/2～2/3葉片凋萎;7級(jí)，莖部病斑全部環(huán)繞莖圍，或2/3以上葉片凋萎。統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，計(jì)算相對(duì)防治效果，病情指數(shù)及防治效果計(jì)算公式：

發(fā)病率=n/N×100%

其中，n為發(fā)病株數(shù)，N為調(diào)查總株數(shù)。

病情指數(shù)=（i×ni）/（H×N）×100%

其中，ni表示i病情下發(fā)病株數(shù)，H表示最高病情代表值，N表示調(diào)查總株數(shù)。

相對(duì)防效=（FCK-Ft）/FCK×100%

其中，F(xiàn)CK表示空白組病情指數(shù)，F(xiàn)t表示處理組病情指數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)分析采用Minitab10.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用SPSS18.0軟件進(jìn)行顯著差異性（P<0.05）分析。

47卷1期李娜等煙草黑脛病拮抗菌XA-1的篩選·鑒定及其抑制作用研究

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌的篩選

從恩施咸豐縣、盛家壩和下云壩采集健康煙株樣品20份，采用表面消毒殺菌法從根部共分離73株細(xì)菌，通過(guò)對(duì)峙平板篩選，發(fā)現(xiàn)拮抗效果較好的有7株（表1），其中菌株XA-1抑菌效果最佳，對(duì)煙草黑脛病菌的抑菌直徑大于10mm，抑菌率達(dá)65.23%。菌株XA-1胞外代謝粗提液表現(xiàn)出較好的抑制作用（圖1），對(duì)煙草黑脛病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)82.52%，表明菌株XA-1抑菌物質(zhì)為胞外代謝分泌物。

2.2菌株XA-1的鑒定

根據(jù)96孔板的反應(yīng)結(jié)果，顯示10個(gè)可能的ID，如果10個(gè)SIM值的總和大于0.5時(shí)，系統(tǒng)給出的鑒定結(jié)果ID是一個(gè)屬名，菌株XA-1的10個(gè)ID值總和為0.595，XA-1屬于芽孢桿菌屬（圖2）。將菌株XA-1的16SrDNA基因序列提交NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，得到序列號(hào)為JX069970，將核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)（Blast）后結(jié)果顯示，菌株XA-1與Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42（CP000560）的相似性達(dá)99.73%。選取同源性97%以上相近種屬菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株XA-1與解淀粉芽孢桿菌屬于同一個(gè)聚類，初步鑒定為Bacillusamyloliquefacienssubsp。

2.3生防菌株的盆栽試驗(yàn)

由表2可知，對(duì)照組和處理組均隨著發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)病情指數(shù)不斷提高。當(dāng)盆栽時(shí)間為60d時(shí)，對(duì)照組發(fā)病率達(dá)66.67%，從防治效果看，對(duì)于人工

主動(dòng)接種煙草疫霉變種的煙草植株，在施用濃度107CFU/mL的拮抗菌后，可以有效地降低煙草黑脛病的病情指數(shù)，其中XA-1在第20天時(shí)相對(duì)防效最高為52.38%。由圖3可知，XA-1菌處理組病情指數(shù)顯著低于CK和XS-2處理組，其中在第20天后，相比對(duì)照，XA-1菌處理組病情指數(shù)下降，因此拮抗菌XA-1具備生物防治的潛力，可以做進(jìn)一步的研究。然而拮抗菌相對(duì)防治效果的整體趨勢(shì)下降，一方面可能是煙草B21屬于易感品種，病原菌孢子成功侵入植株后，在植株體內(nèi)存在特定的庇護(hù)場(chǎng)所而不會(huì)受到拮抗菌的影響[13];另一方面可能是拮抗菌在煙草根部的數(shù)量減少，如需進(jìn)一步驗(yàn)證，需要采用分子生物學(xué)技術(shù)考察拮抗菌在煙草根系中的定殖能力。

3結(jié)論與討論

該研究從健康煙草根部分離篩選得到1株對(duì)煙草黑脛病菌拮抗活性較好的細(xì)菌XA-1。菌株XA-1分泌的胞外次生代謝產(chǎn)物對(duì)黑脛病菌絲有很強(qiáng)的抑制效果，一方面與發(fā)酵液中活性物質(zhì)能夠抑制病原菌正常生長(zhǎng)的菌體蛋白的合成有關(guān)，另一方面與拮抗菌產(chǎn)生的某些溶菌酶有關(guān)[14]。經(jīng)Biolog微生物和分子生物學(xué)分類鑒定，菌株XA-1初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌B.amyloliauefaciens。溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，拮抗菌XA-1可有效地降低煙草黑脛病的病情指數(shù)，在第20天時(shí)相對(duì)防效最高為52.38%，因此拮抗菌XA-1具備生物防治的潛力。

在防治經(jīng)濟(jì)作物的土傳病害過(guò)程中，生防研究為經(jīng)濟(jì)作物病害管理系統(tǒng)提供新的手段。農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要必然會(huì)減少化學(xué)殺蟲(chóng)劑的施用量，低毒、無(wú)害、綠色、環(huán)保的生防菌劑將成為化學(xué)殺蟲(chóng)劑的替代產(chǎn)品。芽孢桿菌屬細(xì)菌好氧或兼性厭氧，營(yíng)腐生生活，生理特征多樣化，抗逆性強(qiáng)，繁殖快，營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單，適生性強(qiáng)。其突出的特征是產(chǎn)生耐熱抗逆的內(nèi)生芽孢，這有利于生防菌劑（Biologicalcontrolagent

BCA）的生產(chǎn)、加工和保存，也有利于菌體在環(huán)境中存活與

定殖[15]。Elliott等[16]考察了4種生防菌劑和化學(xué)農(nóng)藥在棉花和扁豆應(yīng)用中的可靠性和穩(wěn)定性。田間試驗(yàn)效果表明，芽孢桿菌菌劑在不同植物和不同年份比非芽孢桿菌菌劑穩(wěn)定并能發(fā)揮長(zhǎng)期的效用，而且可以與化學(xué)農(nóng)藥混合使用。

從理論上講，任何能夠降低植物病原微生物數(shù)量或致病性的微生物都屬于生物防治的微生物資源，從豐富的微生物資源篩選出高效的拮抗菌是生物防治技術(shù)成功的關(guān)鍵。該研究從煙草植株中分離篩選的菌株XA-1對(duì)煙草黑脛病原菌有較高的拮抗性，具有潛在的應(yīng)用前景。然而一種生防菌劑從實(shí)驗(yàn)室到田間推廣是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，該研究?jī)H對(duì)XA-1菌株的分離鑒定、拮抗活性及室內(nèi)盆栽效果進(jìn)行研究，要最終實(shí)現(xiàn)田間推廣應(yīng)用，仍需借助分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，了解菌株在煙株中的定殖情況和動(dòng)態(tài)變化。

參考文獻(xiàn)

[1]陳瑞泰，朱賢朝，王智發(fā)，等.全國(guó)16個(gè)主產(chǎn)煙?。▍^(qū)）煙草侵染性病害調(diào)研報(bào)告[J].中國(guó)煙草科學(xué)，1997，18（4）：1-7.

[2]羅詠梅，周佳民，朱三榮，等.植物源藥劑防治煙草黑脛病的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（27）：105-107.

[3]王革，鄭小波，陸家云，等.云南省煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈抗性的檢測(cè)[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，20（4）：105-107.

[4]楊藝煒，黎妍妍，張安盛，等.煙草黑脛病拮抗菌XF10的篩選與鑒定[J].煙草科技，2018，51（4）：20-27.

[5]馬國(guó)勝，高智謀，陳娟.煙草黑脛病研究進(jìn)展[J].煙草科技，2001（9）：44-48.

[6]馬冠華，周常勇，肖崇剛，等.煙草內(nèi)生細(xì)菌Itb57的鑒定及其對(duì)煙草黑脛病的防治效果[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2010，37（2）：148-152.

[7]FRAVELDR，SPURRHW.Biocontroloftobaccobrown-spotdiseasebyBacilluscereussubsp.mycoidesinacontrolledenvironment[J].Phytopathology，1977，67（7）：930-932.

[8]SILVANIVA，F(xiàn)RACCHIAS，F(xiàn)ERNNDEZL，etal.Asimplemethodtoobtainendophyticmicroorganismsfromfield-collectedroots[J].SoilBioandBiochem，2008，40（5）：1259-1263.

[9]CHENC，BAUSKEEM，MUSSONG，etal.BiologicalcontrolofFusariumwiltoncottonbyuseofendophyticbacteria[J].Biologicalcontrol，1995，5（1）：83-91.

[10]BERGERF，LIH，WHITED，etal.Effectofpathogeninoculum，antagonistdensity，andplantspeciesonbiologicalcontrolofPhytophthoraandPythiumdamping-offbyBacillussubtilisCot1inhigh-humidityfoggingglasshouse[J].Phytopathology，1996，86（5）：428-433.

[11]WANGLT，LEEFL，TAICJ，etal.ComparisonofgyrBgenesequences，16SrRNAgenesequencesandDNADNAhybridizationintheBacillussubtilisgroup[J].IntJSystEvolMicr，2007，57：1846-1850.

[12]方敦煌，吳祖建，鄧云龍，等.防治煙草赤星病拮抗根際芽孢桿菌的篩選[J].植物病理學(xué)報(bào)，2006，36（6）：555-561.

[13]JOHNSONKB.Pathogenrefuge：Akeytounderstandingbiologicalcontrol[J].Annualreviewofphytopathology，2010，48：141-160.

[14]RYANRP，GERMAINEK，F(xiàn)RANKSA，etal.Bacterialendophytes：Recentdevelopmentsandapplications[J].FEMSMibiolLett，2008，278（1）：1-9.

[15]FRAVELDR.Commercializationandimplementationofbiocontrol[J].AnnuRevPhysiol，2006，43：337-359.

[16]ELLIOTTML，DESJARDINEA，BATSONWEJR，etal.Viabilityandstabilityofbiologicalcontrolagentsoncottonandsnapbeanseeds[J].PestManagSci，2001，57（8）：695-706.

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