梁珊珊， 王 羽， 滕曉明

(同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院輔助生殖科，上海 201204)

隨著精準醫(yī)學(xué)的發(fā)展，臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中治療的預(yù)后預(yù)測開始向基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究尋求依據(jù)。伴隨體外受精/單精子卵胞漿內(nèi)注射-胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection embryo transfer, IVF/ICSI-ET)患者及胎兒染色體檢查的開展和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷及篩查(preimplantation genetic diagnosis/screening, PGD/S)的應(yīng)用，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)在生殖領(lǐng)域開始凸顯其重要性。而作為人群中較為常見的遺傳學(xué)變化之一，D/G組染色體隨體多態(tài)性變異漸漸進入了生殖醫(yī)學(xué)臨床工作者的視野，其與不孕癥、流產(chǎn)、胎兒畸形有何關(guān)聯(lián)也成為研究的熱點。本研究回顧性分析54例此類患者的相關(guān)臨床資料，初步探討了染色體變異對受精、胚胎及妊娠的影響，并分析了變異攜帶者的性別效應(yīng)。

1 資料與方法

1.1 染色體核型檢查及結(jié)果報告

成人抽取肝素抗凝靜脈血2mL，培養(yǎng)淋巴細胞72h后，秋水仙素處理使細胞有絲分裂停滯于中期，制片后G顯帶，鏡檢分析50個細胞核型。根據(jù)人類細胞遺傳學(xué)命名國際體制(ISCN 2009)結(jié)果，46，XX為正常女性，46，XY為正常男性。人類D組染色體包括13號、14號、15號；G組染色體包括21號、22號；Y染色體無隨體。隨體區(qū)域以s表示，ss表示雙隨體，pstk表示短臂隨體柄。另外，+表示增加，-表示減少。

1.2 研究對象

2010年11月—2017年8月期間在同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院輔助生殖中心行IVF/ICSI-ET治療，外周血淋巴細胞染色體核型分析提示夫婦一方D/G組染色體隨體變異患者54例作為病例組(DGs組)。其中女方攜帶21例，男方攜帶33例；D組變異21例，G組變異33例；IVF組42例，ICSI組12例。

對照組選取夫妻染色體均正常、女方與病例組女方同齡，同期首次IVF/ICSI治療周期病例(受精方式相同，取卵日期最為相近者入選)，排除凍卵、供精及凍精授精周期，取卵周期108個(病例: 對照為1∶2)。

1.3 IVF/ICSI-ET診療

按照WHO診斷標準，對于婚后正常性生活1年未避孕未孕的夫婦，進行體格檢查及生殖系統(tǒng)檢查后，因輸卵管因素、排卵障礙、男方因素、不明原因等進行IVF/ICSI-ET治療。詢問夫妻雙方家族史、遺傳性疾病史、婚育史并記錄后，按照本中心常規(guī)進行藥物治療及各項手術(shù)及實驗室操作。

1.4 胚胎學(xué)結(jié)果、妊娠及生育結(jié)局隨訪

ICSI周期取卵當日去除顆粒細胞后見第一極體為成熟卵子，予以單精子胞漿內(nèi)注射。授精后17h可見原核或后續(xù)發(fā)育中可見卵裂的卵子計入受精卵，見多于2個原核者及ICSI來源的1個原核者均為異常受精卵。受精后分裂為≥2個細胞者計入卵裂胚胎。在胚胎培養(yǎng)過程中按照中心常規(guī)判定為可移植的胚胎計入可用胚胎數(shù)。IVF周期受精率為受精數(shù)占總獲卵數(shù)百分比，ICSI周期受精率為受精數(shù)占注射成熟卵子數(shù)百分比。異常受精率為異常受精數(shù)占受精數(shù)百分比。卵裂率為卵裂數(shù)占受精數(shù)百分比?？捎门咛ヂ蕿榭捎门咛?shù)占卵裂數(shù)百分比。

胚胎移植術(shù)后第14天查尿hCG及血hCG，陽性者移植術(shù)后4周經(jīng)陰道超聲檢查見妊娠囊為臨床妊娠，預(yù)產(chǎn)期后電話及門診隨訪分娩情況。一次臨床妊娠有至少一個新生兒活產(chǎn)的記為活產(chǎn)周期。胚胎種植率為孕囊數(shù)占移植胚胎數(shù)百分比，臨床妊娠率為臨床妊娠周期占新鮮移植周期數(shù)百分比，活產(chǎn)率為活產(chǎn)周期占臨床妊娠周期百分比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 DGs病例組與對照組IVF/ICSI-ET結(jié)果比較

DGs病例組54例與對照組108例IVF/ICSI后數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，胚胎學(xué)結(jié)果中受精率、卵裂率、可用胚胎率均未見明顯差異；新鮮胚胎移植后臨床妊娠率、胚胎種植率及活產(chǎn)率均未見明顯差異(P>0.05)，見表1～2。DGs病例組異常受精率在IVF時明顯高于對照組，而在ICSI中未見明顯差異(P>0.05)。DGs病例組卵子成熟率在ICSI時較低，其他指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 IVF治療DGs病例組與對照組胚胎情況及臨床妊娠結(jié)局

*P<0.05；#為Fisher精確檢驗

表2 ICSI治療DGs病例組與對照組胚胎情況及臨床妊娠結(jié)局

*P<0.05；#為Fisher精確檢驗

2.2 DGs女性攜帶者與男性攜帶者IVF-ET結(jié)果比較

在IVF治療組中，女性攜帶者受精率、臨床妊娠率、胚胎種植率均顯著高于男性攜帶者，見表3。盡管女性攜帶者夫妻年齡均明顯高于男性攜帶者夫妻，女性攜帶者的胚胎及妊娠結(jié)局仍優(yōu)于男性攜帶者。

表3 IVF治療DGs病例女性及男性攜帶者胚胎情況及臨床妊娠結(jié)局

*P<0.05；#為Fisher精確檢驗

2.3 DGs患者分娩結(jié)局隨訪

DGs病例IVF組活產(chǎn)周期11例，活產(chǎn)新生兒17名，子代性別為9男8女；異位妊娠周期1例，早孕單胎流產(chǎn)周期1例(流產(chǎn)物核型未測)。ICSI組活產(chǎn)周期5例，活產(chǎn)新生兒5名，子代性別為3男2女。新生兒期隨訪均未見出生缺陷，但子代染色體檢測的結(jié)果尚缺。

3 討 論

3.1 D/G組染色體隨體的細胞遺傳學(xué)表現(xiàn)及其變異

人類染色體共46條，按照大小和形態(tài)分為A-G組，在核型圖中以同源染色體成對排列。D組染色體包括13號、14號、15號；G組染色體包括21號、22號及Y染色體。這兩組染色體的著絲粒均位于染色體一端，被稱為遠端著絲粒染色體。短臂(p)、隨體(s)、隨體柄(stk)三部分較少參與基因表達，而參與核仁形成，并隨年齡增大可能增加染色體重排及染色體病[1]。在染色體顯帶時，隨體區(qū)域常表現(xiàn)為耐熱、富含GC、Q帶呈現(xiàn)暗帶、R帶呈現(xiàn)亮帶，銀染陽性[2]。隨體區(qū)的變異可表現(xiàn)為雙隨體、多隨體、隨體增大、隨體減少及隨體柄增大及減少。

3.2 D/G組染色體隨體變異與生殖異常的前期研究

關(guān)于D/G組染色體隨體變異是否與生殖異常相關(guān)已有前期研究。1989年，有研究[3]提示雙隨體親代并未引起子代21三體發(fā)病率增高。2004年，研究[4]對73例G顯帶隨體增加病例進行總結(jié)，臨床病史包括不孕不育、自然流產(chǎn)，曾生育過畸形患兒，具有先天畸形者，智力低下；但提示無任何隨體增加與臨床表現(xiàn)的因果聯(lián)系的依據(jù)，僅為此領(lǐng)域的進一步研究提供參考[4]。2011年，上海報道男女性核型多態(tài)性變異輔助生殖病例，包含D/G組染色體隨體增大者，胚胎種植率及繼續(xù)妊娠率與對照相似[5]。2012年，研究[6]提示不孕人群與對照組中D/G組染色體隨體增大占比無差別。

而另有研究則給出了需要特別關(guān)注染色體變異與生殖異常關(guān)系的結(jié)論。例如，2008年土耳其研究138對不孕夫妻含4例D/G組染色體隨體變異，同期對照羊膜腔穿刺樣本1130例中8例變異[7]比例更低。2009年，有研究在對1205例生殖異常患者中，檢出29例隨體區(qū)變異(占2.4%)[8]。研究[9]針對男性或女性不孕不育患者，D/G組染色體隨體變異總體概率在1685例男性為4.09%，1441例女性患者為4.16%。2010年，有研究[10]檢測了不良孕產(chǎn)史夫婦共1374對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D、G組染色體隨體變異25例，檢出率為0.91%。另有張璘團隊[11]從4541例不孕不育患者中檢出染色體13號大隨體29例，14號大隨體37例，15號大隨體37例，21號大隨體53例，22號大隨體41例，總體檢出率4.34%。2017年，研究[12]分析了行遺傳咨詢及輔助生殖的生殖異常夫婦4001對，檢出D、G組染色體隨體變異71例，其在人群中的發(fā)生率為0.89%(71/8002)。上述研究反映了不孕不育人群中D/G組染色體隨體變異的存在情況，但檢出率區(qū)間為0.89%～4.34%，存在較大差異。其原因可能是患者人群差異，也可能存在核型檢測形態(tài)判定標準不同。同時，也缺乏后續(xù)助孕治療的子代隨訪情況。

3.3 D/G組染色體隨體變異患者胚胎結(jié)局

本研究顯示在IVF組中，異常受精率在病例組較高(11.53%vs7.78%，P=0.038)，其他指標均未見顯著性差異。在ICSI組中，異常受精率降低到了病例組的3.33%和對照組的3.41%，未見差異；成熟卵子率在病例組中較低(76.97%vs85%，P=0.037)，其他指標均未見顯著性差異。

IVF多原核現(xiàn)象多由多精受精導(dǎo)致，也可能與原核分裂有關(guān)；另可能與促排卵中雌激素水平較高，卵巢高反應(yīng)相關(guān)[13-14]。ICSI操作時在卵胞漿中注射單個精子，可避免多精受精，減少多原核現(xiàn)象出現(xiàn)。ICSI多原核現(xiàn)象多由第二極體未排出導(dǎo)致[13]。

DGs病例IVF時異常受精率增高，其機制尚不明確，可以通過進一步的胚胎遺傳學(xué)檢測獲取證據(jù)。而ICSI授精方式有助于避免多精受精發(fā)生，無論對于對照組還是病例組，異常受精比例均有減少，且最終達到同樣的較低水平。這一結(jié)果提示DGs病例IVF時異常受精率增高可能與多精受精增加有關(guān)，當通過ICSI排除多精受精情況后，異常受精率降低到了與對照組相同的水平。是否需要針對DGs病例全部應(yīng)用ICSI授精以減少異常受精風(fēng)險還需綜合考慮患者整體情況決定。

同時，ICSI組成熟卵子率較低，深入分析數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)，ICSI組女性攜帶者2例，分別獲卵22枚成熟16枚，獲卵15枚成熟15枚，卵子成熟率83.78%。ICSI組男性攜帶者10例，獲卵總計115枚，成熟86枚，卵子成熟率74.78%。促排卵過程中卵子成熟僅能作為女方治療結(jié)果評估指標，此結(jié)果不能說明隨體變異會帶來不利影響。

由此可見，DGs患者在IVF/ICSI-ET治療后所獲得的胚胎培育結(jié)果與普通不孕癥人群相似。這一結(jié)果為輔助生殖技術(shù)中DGs患者及臨床醫(yī)生提拱了風(fēng)險評估參考。但本研究也發(fā)現(xiàn)了可以影響預(yù)后的相關(guān)因素，例如攜帶者性別。

3.4 DGs攜帶者性別效應(yīng)

因ICSI治療組病例數(shù)限制，未能做攜帶者性別相關(guān)分類研究。而在IVF治療組中，盡管女性攜帶者夫妻年齡均明顯高于男性攜帶者夫妻，女性攜帶者受精率、臨床妊娠率、胚胎種植率均顯著高于男性攜帶者。

男性攜帶者的治療妊娠結(jié)局差，胚胎發(fā)育潛能可能受到不良影響，其產(chǎn)生原因尚不明確。2015年，針對男性非梗阻性不育患者染色體核型異常及多態(tài)性發(fā)生率研究顯示，在少弱畸精子癥組中，隨體多態(tài)性占28.13%，染色體核型異常及多態(tài)性對男性患者生育能力有直接影響[15]。2017年，報道[12]顯示D、G組染色體多態(tài)性與不育、反復(fù)自然流產(chǎn)、少弱精子癥等臨床生殖異常有相關(guān)性。但均尚缺乏對致病機制的研究。男性DGs攜帶者IVF/ICSI-ET治療后結(jié)局不良，是否與隨體變異后的相關(guān)功能改變，導(dǎo)致配子發(fā)生時的減數(shù)分裂過程中染色體分離異?？梢酝ㄟ^單倍體整倍性檢測檢出。合子后有絲分裂中染色體分離異常、胚胎整倍體性可以通過胚胎植入前遺傳學(xué)檢測繼續(xù)探究。隨體生物學(xué)行為是否存在類似印記基因的父源/母源功能區(qū)別有待探究。

3.5 D/G組染色體隨體變異患者妊娠分娩結(jié)局

DGs病例組與對照組在新鮮胚胎移植后臨床妊娠率、胚胎種植率及活產(chǎn)率均未見明顯差異，并未發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)率異常增高。病例組妊娠后隨訪發(fā)現(xiàn)1例異位妊娠，1例宮內(nèi)妊娠早孕期自然流產(chǎn)，均未行流產(chǎn)絨毛染色體檢查；未發(fā)現(xiàn)妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤病例。新生兒期隨訪均未見出生缺陷。新生兒性別為12男10女。

本研究尚有未能完善之處，因患者妊娠需求和治療流程的限制，冷凍胚胎的移植預(yù)后尚不明確，也未能計算全部所獲胚胎的累計妊娠率。已妊娠生育的患者可能終將選擇放棄剩余胚胎。

本研究中并未按照變異類型、涉及染色體進一步分類討論，原因在于收集到的病例數(shù)有限，尚不能體現(xiàn)各組之間結(jié)局有無差異。先前研究[16]提示，僅15號染色體就可以利用多種染色方法區(qū)分8種多態(tài)性變異，各種變異的產(chǎn)生機制及其對生殖過程的影響很有可能不同。并且，有研究[17]報道22號隨體增加出現(xiàn)了“跳到”其他遠端著絲粒染色體上的嵌合情況。在孕前優(yōu)生健康檢查推廣過程中，有不良孕產(chǎn)史的高危人群可考慮增加染色體核型檢測[18]。隨體的生物學(xué)功能和行為，以及各種變異在人群中的分布情況尚需深入研究。

總之，對于細胞遺傳學(xué)所提示的D/G組染色體隨體變異個體，臨床上可通過家族史、個人體格檢查及生殖系統(tǒng)檢查、不良生育史等方面綜合評價生育風(fēng)險。已妊娠病例可建議正規(guī)產(chǎn)檢及產(chǎn)前診斷以減免畸形兒出生。通過IVF/ICSI-ET可獲得與普通不孕癥人群類似的治療結(jié)局，ICSI授精方式可減少異常受精，男性攜帶者可能面臨較差的臨床結(jié)局。本研究病例數(shù)有限，尚屬初步探究，機制研究及出生子代的隨訪亦為起步階段，還需進一步總結(jié)病例并觀察長期影響。