羅敏　張輝　張麗鴻　江金歡　張妮婭　周東海

摘要：為探討納米硒對(duì)鉻（Cr）中毒肉雞肝臟的保護(hù)作用，試驗(yàn)以120只1日齡肉雞作為模式動(dòng)物，將肉雞隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、Cr（Ⅵ）中毒組、保護(hù)組、治療組、預(yù)防組和納米硒對(duì)照組，通過觀察14、21、28、35日齡肉雞的生長性能、分析肝臟的組織病理學(xué)形態(tài)、測(cè)量體重變化和臟器指數(shù)，研究納米硒對(duì)鉻中毒肉雞肝臟損傷的防治作用及潛在的機(jī)制。結(jié)果表明，與Cr（Ⅵ）中毒組相比，納米硒處理組肉雞生長狀況良好，且臟器指數(shù)顯著低于Cr（Ⅵ）中毒組（P<0.05）；納米硒保護(hù)組、治療組、預(yù)防組肉雞的肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相較于Cr（Ⅵ）中毒組顯著恢復(fù)。因此，納米硒能夠?qū)r（Ⅵ）中毒肉雞肝臟產(chǎn)生保護(hù)性作用，這為臨床防治鉻中毒研究及新藥開發(fā)提供了新的思路。

關(guān)鍵詞：肉雞；肝臟；重鉻酸鉀；納米硒；鉻中毒

中圖分類號(hào)：S859.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2019）04-0005-03

鉻（Cr）是一種在自然界中廣泛存在的重金屬元素，而Cr（Ⅵ）作為一種強(qiáng)氧化劑具有高毒性，多數(shù)被用在工業(yè)生產(chǎn)中。不合理的使用鉻會(huì)引起靶器官的肝毒性、氧化應(yīng)激和細(xì)胞毒性。Cr（Ⅵ）主要通過消化道、皮膚、呼吸道這三種途徑被機(jī)體所吸收[1]。經(jīng)消化道和皮膚攝入少量的Cr（Ⅵ）大多數(shù)均能被還原為Cr（Ⅲ），過量的Cr（Ⅵ）則會(huì)引起皮膚過敏、皮炎、潰瘍，胃腸道黏膜糜爛、胃炎、肝炎等癥狀；而經(jīng)呼吸道攝入鉻主要會(huì)對(duì)暴露于鉻工廠的工人造成嚴(yán)重的健康危害，如：鼻中膈潰瘍、鼻黏膜出血、肺炎、呼吸短促等[2]。研究表明，8 μmol/L以上的K2Cr2O7會(huì)誘使體外培養(yǎng)的L-02肝細(xì)胞DNA產(chǎn)生損傷[3]。考慶君等[4]在給大鼠日糧中添加10%LD50的K2Cr2O7后，其肝臟組織HE切片表現(xiàn)出明顯的肝竇擴(kuò)張、出血、肝細(xì)胞壞死等。王勝男[5]給肉雞喂食K2Cr2O7后，檢測(cè)到一些抗氧化酶活性指標(biāo)如超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）等相比空白組明顯降低。目前的研究證明鉻導(dǎo)致機(jī)體毒性的機(jī)制主要是：Cr（Ⅵ）進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)被抗壞血酸等還原劑還原產(chǎn)生活性氧簇（ROS），同時(shí)產(chǎn)生一些中間體導(dǎo)致一系列的毒性效應(yīng)；并且在此過程中產(chǎn)生過量的Cr（Ⅲ）也會(huì)造成DNA的損傷。

根據(jù)鉻中毒引起機(jī)體氧化損傷的機(jī)制，補(bǔ)充抗氧化劑被視為是一種良好的拮抗鉻毒性的方法。研究指出，納米硒具有較高的表面活性、吸收效率、安全性等，能夠提高機(jī)體的抗氧化活力、抵抗力、改善胴體品質(zhì)等[6]。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體受到強(qiáng)氧化劑鉻的損傷時(shí)，大量的不飽和脂肪酸便會(huì)被氧化形成脂質(zhì)過氧化物。胥保華等[7]、胡彩虹等[8]的研究指出，添加0.3～1.0 μmol/L的納米硒到肉雞飼料中能夠使細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）維持在一個(gè)較高的水平，該酶能夠清除機(jī)體內(nèi)蓄積的脂質(zhì)過氧化物，從而發(fā)揮其抗氧化防御機(jī)制。

由于目前納米硒對(duì)鉻中毒肉雞肝臟的防治研究非常有限，且納米硒具有無機(jī)硒和有機(jī)硒所不具備的高效性、低毒性、生物活性和超高的利用率。因此本試驗(yàn)以鉻中毒肉雞為研究對(duì)象，旨在觀測(cè)納米硒對(duì)鉻中毒肉雞肝臟損傷的防治作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 120只1日齡AA肉雞（購于武漢市正大公司）。

1.1.2 主要試劑及儀器 重鉻酸鉀（K2Cr2O7，分子質(zhì)量294.19）、納米硒（含量99.99%，200目，平均粒徑40 nm），武漢谷歌生物科技公司；蘇木素伊紅染色試劑盒、10%福爾馬林溶液，武漢博士德生物公司；RM-2245萊卡組織切片機(jī)，德國萊卡公司；KD-P攤片機(jī)、KD-H烘片機(jī)，浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司；OLYMPUS，CX41光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯光學(xué)株式會(huì)社。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組及給藥方法 將1日齡的AA肉雞120只飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為以下6組：空白對(duì)照組（C），飼喂基礎(chǔ)日糧和清水；鉻中毒組（Ga），飼喂0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7至第35日齡；保護(hù)組（Gb），同時(shí)飼喂0.5 mg/（kg·d）的納米硒和0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7至第35日齡；治療組（Gc），飼喂2周0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7后飼喂2周0.5 mg/（kg·d）的納米硒；預(yù)防組（Gd），飼喂2周0.5 mg/（kg·d）的納米硒后飼喂2周0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7；納米硒對(duì)照組（Ge），在日糧中添加0.5 mg/（kg·d）的納米硒飼喂至第35日齡。自由采食及飲水，室溫控制在34 ℃左右，每周控制溫度下降2～3 ℃直至恒溫，相對(duì)濕度為50%～65%。

1.2.2 Cr（VI）中毒肉雞的生長性能檢測(cè) 在整個(gè)試驗(yàn)周期中，每天定期觀察并記錄肉雞臨床癥狀變化；按照試驗(yàn)階段將其分為四個(gè)染毒周期（14 d、21 d、28 d、35 d），在每個(gè)染毒周期結(jié)束時(shí)，記錄肉雞體重情況。

1.2.3 樣本采集及肝臟病理切片觀察 分別于第14、21、28、35天宰殺各組肉雞5只，肝臟稱重，一部分保存于-80 ℃?zhèn)溆?，一部分固定?%的多聚甲醛液中。固定24 h后修整組織形狀，利用乙醇脫水，水楊酸甲酯過夜透明，石蠟包埋，修整蠟塊，切片（厚度5～6 μm），最后H&E染色，OLYMPUS，CX41光學(xué)顯微鏡觀察及拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米硒對(duì)鉻中毒肉雞生長狀況的影響

研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組肉雞生長發(fā)育良好，飲水、采食正常，精神狀態(tài)良好；鉻中毒組肉雞行動(dòng)遲緩，精神沉郁，食欲、飲欲明顯降低，羽毛干枯不飽滿；與鉻中毒組相比，納米硒對(duì)照組、保護(hù)組、治療組、預(yù)防組肉雞精神較好，體型較大，羽翼豐滿。

2.2 納米硒對(duì)鉻中毒肉雞體重變化的影響

由圖1可見，隨著飼喂時(shí)間的增長，各組肉雞的體重依次上升；與正常對(duì)照組相比，鉻中毒組肉雞體重增加較慢（P<0.05），且各時(shí)期體重最低；納米硒對(duì)照組肉雞整體上升趨勢(shì)最為明顯，且各時(shí)期體重最高（P<0.05）；除納米硒對(duì)照組，治療組和預(yù)防組肉雞體重變化趨勢(shì)無明顯組間差異（21 d、28 d、35 d的保護(hù)組肉雞除外）。

2.3 納米硒對(duì)鉻中毒肉雞肝臟臟器系數(shù)的影響

由圖2可見，與空白對(duì)照組相比，在四個(gè)不同時(shí)期（14 d、21 d、28 d、35 d）鉻中毒組肉雞臟器系數(shù)呈顯著增加趨勢(shì)（P<0.05）；各試驗(yàn)組在第35天時(shí)臟器系數(shù)最低；在四個(gè)不同時(shí)期，納米硒對(duì)照組與空白對(duì)照組相比其臟器系數(shù)稍高；納米硒保護(hù)組、治療組、預(yù)防組肉雞臟器系數(shù)在14 d和21 d呈上升趨勢(shì)，在28 d和35 d呈下降趨勢(shì)，差異性均不顯著（P>0.05）。

2.4 納米硒對(duì)鉻中毒肉雞肝臟病理結(jié)構(gòu)的影響

試驗(yàn)第14、21、28、35天肉雞肝臟的病理結(jié)構(gòu)見圖3（A、B、C、D）所示。由圖3可見，各時(shí)期的空白對(duì)照組肉雞肝臟結(jié)構(gòu)清晰可辨，細(xì)胞核和細(xì)胞漿均呈現(xiàn)正常狀態(tài)；納米硒對(duì)照組病理切片與空白對(duì)照組相比無明顯差異；與空白對(duì)照組相比，鉻中毒組肉雞肝細(xì)胞索排列紊亂、肝竇間隙充滿紅細(xì)胞、肝竇變窄、且細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等、數(shù)量不一的圓形空泡，隨著鉻飼喂時(shí)期的延長，鉻毒性所致的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷更為嚴(yán)重；與鉻中毒組相比，不同時(shí)期的納米硒保護(hù)組、治療組、預(yù)防組肉雞肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯著恢復(fù)，但肝竇間隙仍存在少量的紅細(xì)胞。

3 小結(jié)與討論

近年來，鉻在各行各業(yè)的使用及對(duì)環(huán)境造成的污染引起了人們的廣泛關(guān)注，其中Cr（Ⅵ）作為強(qiáng)氧化劑進(jìn)入機(jī)體后會(huì)導(dǎo)致肝臟細(xì)胞受損，進(jìn)而使血液中AST、ALT、GGT水平升高；也會(huì)導(dǎo)致腎臟的近曲小管和腎小球損傷；上呼吸道黏膜受損出血、誘發(fā)肺水腫和呼吸困難以及使生殖器官的功能、精子活力和數(shù)量下降；DNA鏈斷裂；紅細(xì)胞破裂、機(jī)體貧血等。目前的研究觀點(diǎn)認(rèn)為Cr（Ⅵ）誘使機(jī)體一系列毒性反應(yīng)的機(jī)制是其導(dǎo)致過度的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基，機(jī)體不能及時(shí)有效清除蓄積的自由基而處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[9，10]。

中國作為一個(gè)養(yǎng)雞大國，其生產(chǎn)的肉雞普遍銷售至國外，然而由于集約化的養(yǎng)殖限制了肉雞的生長，因此如何提高肉雞胴體品質(zhì)及飼料轉(zhuǎn)化率等成為了人們關(guān)注的熱點(diǎn)。大量研究表明，Cr（Ⅲ）因其介導(dǎo)葡萄糖耐量因子（GTF）發(fā)揮胰島素的作用，從而促進(jìn)機(jī)體攝取糖分的能力加強(qiáng)、脂肪水解加強(qiáng)、氨基酸和蛋白質(zhì)合成增加[11-13]。因此越來越多的研究人員在飼料中添加鉻來觀察其對(duì)畜禽生長的影響，研究結(jié)果證實(shí)飼料中添加適宜劑量Cr（Ⅲ）能夠促進(jìn)畜禽生長發(fā)育，提高胴體品質(zhì)等。但由于基層養(yǎng)殖人員對(duì)Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）的作用機(jī)制不明確，導(dǎo)致Cr（Ⅵ）的錯(cuò)誤添加，這在很大程度上影響了畜禽業(yè)的持續(xù)發(fā)展，同時(shí)也導(dǎo)致了嚴(yán)重的生物富集現(xiàn)象，進(jìn)一步危害了人類的健康。

眾所周知的是，一些天然的抗氧化劑如維C、維E、多酚、硒等能夠絡(luò)合重金屬離子來消除其毒性，并且清除自由基而起到保護(hù)動(dòng)物機(jī)體的作用[14，15]。納米硒作為一種新型的納米材料，結(jié)合了納米和硒的共同優(yōu)勢(shì)，之前主要在大鼠上進(jìn)行研究，禽類研究較少。本試驗(yàn)采用納米硒作為抗氧化劑拮抗鉻中毒所致的肉雞肝臟損傷，探討納米硒處理后的鉻中毒肉雞肝臟的一般毒性指標(biāo)和病理組織學(xué)切片變化。

大量的研究表明，衡量動(dòng)物健康狀況的指標(biāo)有臟器的顏色、質(zhì)地、光澤度、大小及質(zhì)量等，而本試驗(yàn)通過對(duì)肉雞鉻中毒重要的靶器官肝臟及肉雞體重進(jìn)行測(cè)量分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，給健康的肉雞飲水中添加K2Cr2O7后，肉雞體重比同時(shí)期空白對(duì)照組肉雞體重減輕，提示Cr（Ⅵ）對(duì)肉雞的生長發(fā)育存在一定的負(fù)面影響，而用納米硒處理Cr（Ⅵ）中毒的肉雞其體重明顯升高，提示納米硒能夠修復(fù)鉻中毒所致的機(jī)體損傷，且進(jìn)一步促進(jìn)肉雞生長。臟器系數(shù)分析結(jié)果表明，鉻處理肉雞后，肉雞肝臟/體重值增加，提示肝臟出現(xiàn)腫大、充血甚至變性，鉻能夠誘使肝臟組織病變；而納米硒的添加能夠降低肉雞肝臟/體重值，但仍高于空白對(duì)照組肉雞肝臟/體重值，提示納米硒對(duì)鉻所致肉雞肝臟組織的損傷具有保護(hù)作用，但并不能完全拮抗鉻對(duì)肉雞肝臟的損害作用。

通過對(duì)處于四個(gè)不同時(shí)期的Cr（Ⅵ）暴露肉雞肝臟的組織病理學(xué)切片觀察分析，發(fā)現(xiàn)其肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整，且肝細(xì)胞核固縮、破裂、溶解，甚至胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡、胞核消失，疑似脂肪變性，隨著攻毒時(shí)期的延長，肝竇間隙內(nèi)紅細(xì)胞滲出增多、肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞愈加明顯、且存在明顯的纖維變性；在對(duì)Cr（Ⅵ）暴露肉雞進(jìn)行納米硒處理后，觀察到各納米硒處理組肉雞肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清晰可辨，出現(xiàn)部分胞核濃染，肝竇間隙的紅細(xì)胞數(shù)量減少，肝細(xì)胞腫大且胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡紅色顆粒，疑似輕微的顆粒變性，提示納米硒對(duì)鉻中毒導(dǎo)致的肉雞肝臟損傷具有緩解作用。王洋[16]發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼料中添加鉻后，肉雞肝臟內(nèi)充滿炎性細(xì)胞、且肝細(xì)胞索排列紊亂、出血嚴(yán)重；而在給鉻中毒肉雞飼喂0.63 mg/kg的亞硒酸鈉后，觀察到肝竇間隙出血減少、肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。

綜上所述，納米硒能夠?qū)r（Ⅵ）中毒肉雞肝臟產(chǎn)生保護(hù)性作用，這為臨床上鉻中毒的藥物開發(fā)提供了新的思路。

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