史兆松，馬棟棟，張淹，李士棟，周祥山

1.東阿阿膠股份有限公司/國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心/山東省膠類中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 聊城 252201； 2.華潤昂德生物藥業(yè)有限公司，山東 聊城 252201

龜鹿二仙口服液由龜甲、鹿角、黨參、枸杞子4味中藥材組成。具有溫腎益精的功效，臨床上主要用于久病腎虛，腰酸膝軟和遺精陽痿等。該產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中缺少鑒別和含量測定方法，為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床用藥安全有效，對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)開展再提升研究。分別對(duì)龜甲、鹿角、黨參、枸杞子四味中藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別，對(duì)甜菜堿進(jìn)行含量測定，為產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate3000型高效液相色譜儀(Dionex)，UltiMate3000系列光電二極管陣列檢測器，色譜柱為丙基酰胺鍵合硅膠為填充劑(150 mm×4.6 mm，5 μm)；BS224S型電子天平(賽多利斯)；C9960A型超聲清洗儀(CBL Photoelectron Technology)；薄層攝像儀(瑞士CAMAG公司)；Mili-Qpius型超純水制備儀(密理博公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)。

1.2 試藥

甘氨酸、甜菜堿、黨參對(duì)照藥材、枸杞子對(duì)照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：110735-200102、110894-200503、121057-201206、121072-201109)；各陰性對(duì)照樣品均為自制；乙腈、甲醇均為色譜純；水為純化水，其余試劑均為分析純。

龜鹿二仙口服液產(chǎn)自東阿阿膠股份有限公司，批號(hào)分別為：20140601、20140602、20140603、20140801、20150101、20150102、20150103、20150401、20150402、20150403。

2 薄層色譜鑒別

2.1 甘氨酸鑒別

取本品1 mL，置具塞試管中，加水2 mL，鹽酸2 mL，密塞，置105 ℃干燥箱中加熱6 h，取出，加水6 mL搖勻，濾液蒸干，殘?jiān)?0%乙醇10 mL使溶解，作為供試品溶液；取缺龜甲、鹿角的陰性樣品同法制成陰性樣品溶液。另取甘氨酸對(duì)照品，加10%乙醇溶解，制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各2 μL、對(duì)照品溶液1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開劑：苯酚-0.5%硼砂水溶液(4∶1)，展開，取出，晾干，置105 ℃干燥箱中加熱10 min，取出，立即噴以2%茚三酮乙醇溶液，至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照色譜中無相應(yīng)斑點(diǎn)，見圖1。

注：1.甘氨酸；2～4.樣品；5.陰性樣品。圖1 甘氨酸薄層色譜圖

2.2 黨參鑒別

取本品60 mL，加水飽和的正丁醇振搖提取3次(40、40、30 mL)，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺黨參的陰性樣品同法制成陰性樣品溶液。另取黨參對(duì)照藥材4 g，分別加水30 mL煎煮兩次，每次30 min，合并煎液，濾過，濾液同法制成黨參對(duì)照藥材溶液。吸取上述3種溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開劑：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(15∶2∶2)，展開，取出，晾干，噴以硫酸-乙醇(1∶1)，置105 ℃干燥箱中加熱約7 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照色譜中無相應(yīng)斑點(diǎn)，見圖2。

注：1.黨參對(duì)照藥材；2～4.樣品；5.陰性樣品。圖2 黨參薄層色譜圖

2.3 枸杞子鑒別

取2.2項(xiàng)下制備的供試品溶液。取缺枸杞子的陰性樣品和枸杞子對(duì)照藥材2 g，同2.2項(xiàng)方法制成陰性樣品和對(duì)照藥材溶液。點(diǎn)樣、展開、顯色等操作同2.2項(xiàng)下方法。結(jié)果見圖3。

注：1.枸杞子對(duì)照藥材；2～4.樣品；5.陰性樣品。圖3 枸杞子薄層色譜圖

3 含量測定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

采用HILIC(丙基酰胺鍵合硅膠)色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-水(80∶20)為流動(dòng)相；柱溫為30 ℃；蒸發(fā)光散射檢測器檢測漂移管溫度為98 ℃；體積流速為0.8 mL·min-1。

3.2 甜菜堿對(duì)照品溶液

精密稱取甜菜堿，加水溶解制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的溶液，即得。

3.3 供試品溶液制備

精密吸取本品20 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇40 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率：800 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，先上預(yù)處理的陰離子樹脂柱(內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為15 cm)，用40 mL水洗脫，收集洗脫液，后上預(yù)處理的陽離子樹脂柱(內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為15 cm)，用40 mL水洗脫至無色，棄去洗脫液，再用15%氨水溶液40 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)舆m量水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性樣品溶液制備

精密吸取缺枸杞子的陰性樣品20 mL，同3.3項(xiàng)方法制成。

3.5 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取上述3種溶液各5 μL，按照3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明，陰性對(duì)照無干擾，見圖4。理論板數(shù)按甜菜堿峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

3.6 檢測限及定量限

將甜菜堿對(duì)照品色譜峰測出的信號(hào)與空白樣品測出的信號(hào)進(jìn)行比較，分別以信噪比為3∶1及10∶1時(shí)注入液相色譜儀的量確定檢測限與定量限，檢測限為0.68 ng，定量限為2.40 ng。

3.7 線性關(guān)系考察

精密稱取甜菜堿4.12 mg，置10 mL量瓶中，加水溶液至刻度，搖勻。分別吸取2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL，按照3.1色譜條件依次進(jìn)樣，測定峰面積。以對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=30.828X+23.654，r=0.999 9。甜菜堿在1.03～6.18 μg呈良好線性關(guān)系。

注：A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照樣品。圖4 甜菜堿HPLC圖

3.8 精密度試驗(yàn)

取3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，按照3.1色譜條件測定峰面積，計(jì)算RSD為1.47%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取本品(批號(hào)：20140801)20 mL，按照3.3項(xiàng)方法制備，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣5 μL，測得峰面積，計(jì)算RSD為2.38%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.10 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取本品(批號(hào)：20140801)6份，按照3.3項(xiàng)方法平行制備，按照3.1項(xiàng)色譜條件，分別進(jìn)樣5 μL測定，甜菜堿平均含量為0.226 mg·mL-1，RSD為1.07%(n=6)，結(jié)果表明重復(fù)性良好，方法可行。

3.11 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取質(zhì)量濃度為0.225 5 mg·mL-1的甜菜堿樣品(批號(hào)：20140801)共6份，每份10 mL，分別精密加入甜菜堿對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為0.488 mg·mL-1)各6 mL，再加水至20 mL，制備6份供試品溶液，按照3.1項(xiàng)色譜條件，分別進(jìn)樣5 μL測定，計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.12 耐用性試驗(yàn)

取本品按照3.1項(xiàng)下方法試驗(yàn)，因甜菜堿為水溶性生物堿成分，很難在C18柱上有所保留，并且無特異的紫外吸收，故確定選用HILIC色譜柱按照3.1項(xiàng)下的色譜條件對(duì)其進(jìn)行測定，含量測定結(jié)果無明顯差別。

3.13 樣品測定

精密量取10批龜鹿二仙口服液樣品(批號(hào)分別為：20140601、20140602、20140603、20140801、20150101、20150102、20150103、20150401、20150402、20150403)，按照3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照3.1項(xiàng)色譜條件，分別進(jìn)樣5 μL測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(n=10)

4 討論

龜鹿二仙口服液是由龜甲、鹿角、黨參、枸杞子4味中藥材組成的中藥復(fù)方制劑，本研究通過色譜分離技術(shù)對(duì)處方中主要成分進(jìn)行定性、定量分析。進(jìn)一步提升了龜鹿二仙口服液質(zhì)控水平，由于處方中成分復(fù)雜，分離困難、干擾多，通過上陰、陽離子樹脂柱進(jìn)行洗脫，除去氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖等成分，達(dá)到純化供試品溶液的目的，使含量測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

原標(biāo)準(zhǔn)中僅采用定氮法測總氮量，專屬性不強(qiáng)、產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較低。通過對(duì)處方成分分析，對(duì)產(chǎn)品中枸杞子有效成分之一甜菜堿進(jìn)行研究，建立了HPLC含量測定方法。甜菜堿系甘氨酸的三甲基衍生物，季胺型水溶性生物堿，基本結(jié)構(gòu)為(CH3)3-N+-CH2-COO-，分子式為C5Hl1N02，分子質(zhì)量為117.11，無共軛結(jié)構(gòu)。純化方法曾采用0.1 mol·L-1異硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液及1 mol·L-1三乙胺的乙腈溶液衍生后測定，發(fā)現(xiàn)衍生后未檢測出理想甜菜堿成分峰；樣品采用單陽離子柱洗脫后，測得成分峰很多且有重疊，甜菜堿成分分離度不理想。供試品選用上陰、陽離子柱洗脫處理后，雜質(zhì)成分較少，沒有出現(xiàn)干擾峰，且甜菜堿成分峰分離度較好。

本文對(duì)處方中全部藥味均進(jìn)行了薄層鑒別，在甘氨酸鑒別中，最初采用正丁醇-乙酸-水(3∶1∶1)為展開劑，但存在拖尾及背景干擾等缺點(diǎn)，經(jīng)摸索，以苯酚-0.5%硼砂水溶液(4∶1)為展開劑時(shí)，分離度較好，展開效果理想，且在105 ℃加熱10 min再噴顯色劑比晾干后顯色要好；在顯色劑方面，2%茚三酮乙醇溶液比0.2%茚三酮乙醇溶液效果更明顯。對(duì)黨參、枸杞子鑒別中，分別選擇各自對(duì)照藥材作對(duì)照，在本實(shí)驗(yàn)選擇確定的薄層色譜條件下，斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對(duì)照無干擾。

龜鹿二仙口服液選取甜菜堿作為控制制劑質(zhì)量的首選目標(biāo)，根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定[1]，枸杞子藥材按干燥品計(jì)算，含甜菜堿不得少于0.30%，依據(jù)龜鹿二仙口服液處方，建議含量測定限度為不得少于0.15 mg·mL-1。