吳金結(jié),李 艷,魏仁初,汪建新,屈樹新,翁 杰,智 偉

(西南交通大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,材料先進(jìn)技術(shù)教育部重點實驗室,成都 610031)

羥基磷灰石(HA)陶瓷作為骨骼的主要無機(jī)成分,具有良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性以及潛在的骨誘導(dǎo)能力[1-3],作為骨修復(fù)替代材料和組織工程骨的支架材料被廣泛應(yīng)用于臨床骨缺損治療中[4-5]。由于材料的生物活性以及力學(xué)穩(wěn)定性在植入初期對骨組織再生過程起著至關(guān)重要的作用[6-8],因此有必要對其生物活性及力學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行體外評價。

研究證實骨原位環(huán)境中磷酸鈣陶瓷具有骨誘導(dǎo)活性,其誘導(dǎo)觸發(fā)機(jī)制是從磷酸鈣陶瓷中釋放出的Ca2+、PO43-、HPO42-導(dǎo)致材料周圍體液環(huán)境出現(xiàn)離子局部過飽和狀態(tài),繼而在材料表面形成包含鈣離子、磷酸根和其他離子(Mg2+,Na+,CO32-)的類骨磷灰石層,同時也使蛋白質(zhì)和其它有機(jī)物沉積其中[3,9]。因此磷酸鈣陶瓷生物活性體外評價通常考察材料的化學(xué)成分、宏觀和微觀幾何結(jié)構(gòu)以及孔隙率等材料因素對鈣離子釋放、蛋白吸附、鈣磷礦化沉積和體外降解性能的影響。但研究同時也發(fā)現(xiàn),生物陶瓷骨誘導(dǎo)性的體外評價結(jié)果與體內(nèi)評價結(jié)果之間常出現(xiàn)較大差異[10]。

目前對生物陶瓷骨誘導(dǎo)性的體外評價方式通常在靜態(tài)環(huán)境中進(jìn)行[11],而如果考慮到材料植入后所處的生理應(yīng)力環(huán)境,在體外考察應(yīng)力環(huán)境作用下材料的生物活性行為就可能更具真實性和準(zhǔn)確性[12-13]。此外,骨作為承力組織始終處于持續(xù)的應(yīng)力負(fù)荷狀態(tài),研究應(yīng)力環(huán)境下對材料力學(xué)性能的影響非常必要[14]。

微振動(Micro Vibration Stress,MVS)是振幅≤50 μm、強度＜1 g、頻率范圍在1～100 Hz的極低幅度、低強度、低頻率的應(yīng)力刺激[15-16],被認(rèn)為是一種生理適宜性的力學(xué)刺激,具有良好的促進(jìn)骨形成和骨重建效應(yīng)[17-18]。研究表明,微振動所引起的流體雙向流動可以模擬生理運動狀態(tài)下骨組織中組織液的雙向流動方式,能促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞向成骨分化,是一種能真實模擬生理應(yīng)力環(huán)境的體外加力方式[10,19]。但迄今為止,針對微振動應(yīng)力環(huán)境與材料生物活性及力學(xué)性能之間相關(guān)性的研究尚未見報道。

基于此,本研究采用前期工作中建立的溶膠-凝膠法制備了HA材料[20-22],考察了MVS對HA材料鈣離子釋放[23]、蛋白吸附[24-25]、生物礦化[26-28]和抗壓性能[29]的影響,并初步探討了力學(xué)因素對磷酸鈣陶瓷骨誘導(dǎo)行為的調(diào)控作用。

1 實驗方法

1.1 原料及試劑

氯化鈉、碳酸氫鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、氯化鎂、N,N-二甲基乙酰胺(Dimethylacetamide,DMAC),鹽酸、氯化鈣、硫酸鈉、Tris均為分析純,由成都科龍化工試劑廠出品。直徑20 μm的球狀HA粉體由四川大學(xué)國家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中心制備。血清白蛋白(BSA)由美國BI公司生產(chǎn);無鈣鎂離子的 PBS緩沖液由美國 GIBCO公式生產(chǎn);鈣離子試劑盒、BCA法蛋白定量測試盒由南京建成生物制劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 微振動參數(shù)

采用自主設(shè)計制備的微振動培養(yǎng)一體裝置(中國發(fā)明專利申請?zhí)枺?01610900515.6;實用新型專利授權(quán)號：ZL 201621126644.6)。目前的研究顯示振幅為50 μm,強度0.3 g的微振動應(yīng)力刺激最有利于誘導(dǎo)細(xì)胞的成骨分化[15],振動頻率在 25～50 Hz范圍內(nèi)上調(diào)成骨細(xì)胞的成骨基因表達(dá)和促進(jìn)骨形成,而60 Hz以上則傾向于抑制細(xì)胞增殖[16],因此在本研究中將樣品分為40 Hz組、60 Hz組、靜態(tài)組。將微振動組樣品牢固固定于振動臺臺面上。振動參數(shù)設(shè)置為：振幅50 μm,強度0.3 g,頻率分別為40 Hz、60 Hz,振動方向及波形：垂直正弦振動。

1.3 HA陶瓷材料制備

1.3.1 制備具有不同表面微孔隙率的HA片

將5 g無水氯化鋰加入100 mL DMAC中,加入0.7 g甲殼素,溶解后形成溶膠。按照HA/Chitin質(zhì)量比 10 ：1、20 ：1 和 35 ：1 分別向溶膠體系中加入HA粉末,攪拌均勻,密封靜置24 h后倒入24孔板內(nèi),每孔加入4 mL漿料,靜置2 h后加入去離子水得到凝膠化的 HA片。用去離子水將三組樣品充分洗滌后干燥,常壓燒結(jié)至1200 ℃(升溫速率為2.5 ℃/min)即得到具有不同微孔隙率的HA片,分別用HA10、HA20、HA35表示。

1.3.2 模板法制備HA多孔支架

按照本課題組前期發(fā)明的方法[26],即將5 g無水氯化鋰加入100 mL DMAC中,加入0.7 g甲殼素,溶解后形成溶膠。按照HA/Chitin質(zhì)量比20/1向溶膠體系中加入 HA粉末,攪拌均勻,密封靜置 24 h后將漿料注入石蠟球粒堆積的模具中,推入去離子水中得到凝膠化的多孔HA支架粗坯。用去離子水充分洗滌樣品使材料粗坯中絕大部分 Li2+溶出,以保證余下痕量 Li2+不會對材料的生物學(xué)性能產(chǎn)生影響[30]。37 ℃干燥,常壓燒結(jié)至 1200 ℃(升溫速率為2.5 ℃/min)即得到HA多孔支架。

1.4 材料表征

利用密度法測定HA片的微孔隙率;采用液體置換法測定HA多孔支架的總孔隙率。Brunauer-Emmett-Teller(BET)法計算 HA片的比表面積;掃描電子顯微鏡(FEI Quanta 200)觀察分析材料的表面微形貌;X-射線衍射儀(XRD,XD1000)分析材料相組成。密度法測定孔隙率的公式如下：

ρ0為H A理論密度(3.16 g/cm3);m為單顆HA球形顆粒的質(zhì)量;V0為致密的HA球形顆粒的體積;V1為實測HA球形顆粒的體積。

液體置換法測定總孔隙率的公式如下：

1.5 MVS對HA陶瓷生物活性的影響

取三組 HA(HA10、HA20、HA35)片按 5 g/100 mL的比例浸泡在不含鈣鎂的PBS中,置于37 ℃,分為40 Hz組、60 Hz組和靜態(tài)組,在浸泡3、7、14 d后,取樣品上清液,在堿性環(huán)境中與甲基百里香酚藍(lán)(MTB)結(jié)合,生成藍(lán)色絡(luò)合物,通過比色與同樣處理的鈣標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較,計算樣本中鈣離子的含量,再計算樣品單位質(zhì)量鈣離子釋放濃度。

取三組 HA(HA10、HA20、HA35)片按 5 g/100 mL的比例加入2 mg/mL的BSA溶液,置于37 ℃,分為40 Hz組、60 Hz組和靜態(tài)組,浸泡1、3 d后,用BCA試劑盒測定上清液中蛋白質(zhì)含量,再根據(jù)質(zhì)量守恒原則計算單位樣品蛋白吸附量。

取三組 HA(HA10、HA20、HA35)片按 5 g/100 mL的比例浸泡在仿生礦化液 SBF中,置于 37 ℃,分為40 Hz組、60 Hz組和靜態(tài)組,進(jìn)行仿生礦化實驗,每24 h更換一次,共礦化3、7 d。純凈水和乙醇輕柔沖洗樣品,80 ℃干燥24 h,用掃描電鏡觀察礦化沉積物形貌,EDS能譜分析鈣磷比。

1.6 力學(xué)穩(wěn)定性測試

將多孔HA支架分為40 Hz組、60 Hz組和靜態(tài)組,按照5 g/100 mL的比例浸入無鈣鎂PBS緩沖液中,置于37 ℃,在0、7、14 d取樣,用純凈水和無水乙醇輕柔沖洗樣品,150 ℃干燥24 h,用電子萬能力學(xué)測試機(jī)(INSTRON,美國)測試(載荷速率為0.5 mm/min,載荷測量精度為1 N,變形測量精度為0.005 mm)函數(shù)記錄儀記錄載荷-變形曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 成分分析及表面微形貌觀察

燒結(jié)后三組HA片和HA多孔支架的XRD結(jié)果(圖1)顯示,各組樣品經(jīng)過 1200 ℃高溫?zé)Y(jié)后,在約 26°、32°、40°、47°、50°的位置均出現(xiàn)了明顯的HA特征峰,與標(biāo)準(zhǔn)圖譜完全吻合(JCPDS09-0432),且未見其他雜相,說明本研究所制備的 HA材料在制備和燒結(jié)過程中沒有引入其他物質(zhì)。

圖1 HA10、HA20、HA35和HA多孔支架燒結(jié)后XRD圖譜Fig.1 XRD patterns of HA10,HA20,HA35 and porous HA scaffolds

掃描電鏡觀察結(jié)果顯示(圖2),HA10表面存在大量微孔,且尺寸分布在 10 μm以下,部分微孔尺寸小于1 μm,HA20微孔數(shù)量少于 HA10,HA35表面光滑、致密,僅存在少數(shù)微孔。多孔 HA支架的總孔隙率為(87.7±2.2)%,其表面形貌與HA20相似,這是因為兩者的漿料配制比例相同。

2.2 MVS應(yīng)力環(huán)境下HA材料的鈣離子釋放

微孔隙率檢測及BET測試結(jié)果顯示,隨著HA粉體比例的提高,HA片微孔隙率呈顯著下降趨勢,HA10微孔隙率為(29±1.2)%,比表面積為121.97 m2/g;HA20微孔隙率為(26.4±0.3)%,比表面積為87.41 m2/g;HA35微孔隙率為(10.6±0.8)%,比表面積為16.53 m2/g。

圖2 HA材料的SEM照片F(xiàn)ig.2 SEM images of HA materials

鈣離子釋放結(jié)果顯示(圖3),三組HA片在靜態(tài)和微振動環(huán)境下其單位質(zhì)量鈣離子釋放濃度均隨時間延長而增加,這說明鈣離子釋放具有時間累積效應(yīng)。靜態(tài)組中隨著 HA材料微孔隙率的降低,Ca2+釋放濃度隨之顯著下降,這是因為比表面積的降低使得鈣磷溶解度減小;而振動組(40 Hz組和60 Hz組)的結(jié)果卻呈相反趨勢,隨著微孔隙率的降低,Ca2+釋放濃度呈顯著上升態(tài)勢。此外,對于具有較高微孔隙率(10%)的HA材料,在40 Hz的MVS應(yīng)力環(huán)境下Ca2+釋放濃度顯著低于靜態(tài)環(huán)境,而在60 Hz時 Ca2+釋放濃度在初期降低,隨后顯著增高;對于微孔隙率較低(35%)的 HA35組,隨著頻率的增加,Ca2+釋放濃度相較于靜態(tài)環(huán)境則始終呈現(xiàn)顯著上升的趨勢。這說明40 Hz應(yīng)力環(huán)境能促進(jìn)具有較高微孔隙率 HA材料的鈣離子再沉積,同時有利于具有低微孔隙率HA材料的鈣磷溶解;而60 Hz應(yīng)力環(huán)境則能促進(jìn)全部HA材料的鈣磷溶解。這可能是因為對于微孔隙率較高的 HA材料來說,其本身較大的比表面積有利于鈣離子的釋放,局部鈣離子濃度已經(jīng)接近飽和濃度,中低頻(40 Hz)的 MVS所引起的流體雙向流動使材料局部鈣離子濃度很快達(dá)到過飽和,從而引起了鈣磷的再沉積,因此溶液中鈣離子濃度較靜態(tài)組顯著降低;而高頻(60 Hz)MVS盡管在早期也引起了鈣磷的再沉積,但高頻所致的流場流體行為最終更利于鈣離子釋放。對于低微孔隙率HA材料,其比表面積較小,鈣離子釋放少,因此MVS對其的影響以促進(jìn)鈣離子釋放為主,頻率越高,鈣離子釋放越多。此外,材料在靜態(tài)環(huán)境和中低頻MVS應(yīng)力環(huán)境中的鈣離子釋放在沉積到第14 d時已經(jīng)趨于平衡狀態(tài),而在高頻 MVS應(yīng)力環(huán)境中則明顯仍以鈣離子釋放為主。Zhi等[10]的研究證實微孔隙率通過對磷酸鈣生物陶瓷比表面積的影響來調(diào)控蛋白吸附和鈣離子的釋放/再沉積過程,從而影響磷酸鈣陶瓷的生物活性。本研究的結(jié)果則進(jìn)一步表明應(yīng)力環(huán)境和材料結(jié)構(gòu)因素對于材料鈣離子釋放/再沉積過程具有共同調(diào)控作用。

圖3 微振動對不同微孔隙率HA陶瓷片鈣離子釋放的影響Fig.3 Calcium release concentration of HA slices with different mass fraction(HA10,HA20,HA35)under 40 Hz and 60 Hz frequency and static state incubation environment at d3,d7 and d14(* represents statistical difference,P＜0.05)

2.3 MVS應(yīng)力環(huán)境下HA材料的蛋白吸附研究

蛋白吸附結(jié)果(圖4)顯示,三組HA片在靜態(tài)環(huán)境和 MVS應(yīng)力環(huán)境下單位質(zhì)量吸附量均隨時間增加,并隨著微孔隙率的降低而呈現(xiàn)下降趨勢,這說明 HA10在表面具有最多吸附位點,這應(yīng)該與其具有最大比表面積相關(guān)。40 Hz 的MVS應(yīng)力環(huán)境下三組 HA片的蛋白吸附量均顯著高于靜態(tài)環(huán)境,而60 Hz的MVS應(yīng)力環(huán)境下三組HA片的蛋白吸附量又顯著低于靜態(tài)組。這可能與 MVS環(huán)境下流體在材料表面流動帶來的剪切應(yīng)力有關(guān)[10],不同頻率的MVS明顯影響了流體的剪切應(yīng)力,從而對材料的蛋白吸附行為造成了顯著的影響。表面吸附蛋白質(zhì)是生物材料植入體內(nèi)后在體液環(huán)境下的初始行為,這一行為對于隨后發(fā)生的細(xì)胞行為及最終植入物的使用效果起著重要的作用[24]。一般認(rèn)為,材料對蛋白的吸附量與其比表面積呈正性相關(guān)[31-32]。本實驗結(jié)果與該結(jié)論一致,并進(jìn)一步揭示了應(yīng)力環(huán)境在磷酸鈣陶瓷蛋白吸附行為中所起到的重要調(diào)控作用。

圖4 微振動對不同微孔隙率HA片蛋白吸附的影響Fig.4 Protein adsorption concentration of HA discs with different mass fraction(HA10,HA20,HA35)under 40 Hz and 60 Hz frequency and static state incubation environment at d1 and d3(* represents statistical difference,P＜0.05)

2.4 MVS應(yīng)力環(huán)境下HA材料的仿生礦化研究

圖5 HA在SBF溶液中3,7 d后的SEM照片F(xiàn)ig.5 SEM results of HA ceramic discs with different mass fraction soaked in SBF solution for 3 and 7 d

三組HA片在靜態(tài)和MVS應(yīng)力環(huán)境中置于SBF溶液中分別浸泡3和7 d后,表面礦化情況如圖5所示。在靜態(tài)環(huán)境中,礦化3 d后,HA10組和HA20組均在表面觀察到大量片狀礦化物沉積,HA35組則為散開的片狀和顆粒狀礦化物混合沉積,且礦化沉積物分布為 HA10組＞HA20組＞HA35組(圖5(a1)、(a3)、(a5))。7 d后在HA10組和HA20組表面的片狀礦化層覆蓋更為密集,而在 HA35組表面沉積的礦化物較 3 d時明顯增多,主要以顆粒狀和絮狀為主(圖5(a2)、(a4)、(a6))。在 40 Hz的 MVS應(yīng)力環(huán)境下,HA10組和HA20組在礦化3 d時即觀察到材料表面有均勻致密的顆粒狀礦化層的覆蓋,并在礦化層上觀察到絮狀礦化沉積物,HA35組表面顆粒狀礦化沉積物零散分布(圖5(b1)、(b3)、(b5));7 d時HA10組和 HA20組礦化層明顯增厚,礦化層上的絮狀礦化物增多、增大,HA35組表面顆粒狀礦化物增多,但與靜態(tài)組相比礦化沉積量較少(圖5(b2)、(b4)、(b6))。在60 Hz的MVS應(yīng)力環(huán)境下,三組HA材料在礦化3 d時表面礦化沉積情況均與40 Hz時相似(圖5(c1)、(c3)、(c5)),但在礦化7 d時HA10組和HA20組表面礦化沉積物并未見明顯增多;而 HA35組表面礦化沉積物則更為疏松(圖5(c2)、(c4)、(c6))。EDS能譜分析結(jié)果(圖6)顯示,礦化 7 d的三組樣品在靜態(tài)組、40 Hz組和60 Hz組的鈣磷比均在1.62～1.73的范圍內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)在仿生礦化過程中,Ca/P摩爾比在 1.5～1.67 范圍內(nèi),產(chǎn)物為 HA+β-TCP(β-Ca3(PO4)2),當(dāng)Ca/P摩爾比在1.68～1.7范圍內(nèi)時,產(chǎn)物為HA,當(dāng)Ca/P摩爾比大于或等于1.7時,產(chǎn)物為HA + CaO[33]。該結(jié)果證實了沉積產(chǎn)物是類骨磷灰石。

磷酸鈣陶瓷的仿生礦化過程包括兩個階段：晶核形成和晶核長大[11]。材料表面的局域鈣磷濃度被認(rèn)為是成核的關(guān)鍵[12]。具有較大比表面積的磷酸鈣陶瓷能提供更多的磷灰石晶體的成核位點,更容易促進(jìn)鈣磷礦化層的成核生長,并且更高的微孔隙率使得更多的來自于材料的Ca2+、PO43-、HPO42-擴(kuò)散到周圍,從而使得鈣磷再沉積更容易發(fā)生。磷酸鈣源的存在是發(fā)生異位骨形成的前提條件之一[34-35]。而本研究的結(jié)果表明,中低頻的 MVS應(yīng)力環(huán)境能夠更好地促進(jìn)具有較高微孔隙率的HA鈣磷離子的礦化沉積,而對具有較低微孔隙率的 HA礦化沉積則顯示出抑制作用;高頻的 MVS應(yīng)力環(huán)境從最終結(jié)果來看并不利于HA的礦化沉積。這可能是因為中低頻的微振動環(huán)境使得模擬體液處于往復(fù)流動狀態(tài),這種流動狀態(tài)加速了表面鈣磷離子溶出。由于粗糙表面具有較多的微孔,這些區(qū)域會阻礙液體的流動和離子的擴(kuò)散,因而較快地達(dá)到成核閾值,一旦晶核形成,流動狀態(tài)更有利于離子的交換,晶核很快長大并均勻分布。而光滑致密表面由于缺少這些“阻礙區(qū)域”,因此離子容易擴(kuò)散,不利于材料表面的離子濃度達(dá)到成核閾值。對于高頻的微振動環(huán)境,模擬體液流速過快以致材料表面的鈣磷離子擴(kuò)散較快,不利于離子濃度達(dá)到成核閾值,因此抑制了HA材料表面類骨磷灰石的形成[12,14,36]。

圖6 HA材料浸泡在SBF溶液中7 d后的EDS能譜分析Fig.6 EDS spectra of HA materials after 7 d in SBF solution

過去的研究顯示,盡管致密 HA的體外仿生礦化結(jié)果顯示其通常能在礦化7 d后形成類骨磷灰石層[10],但體內(nèi)實驗中從未有過致密HA異位骨形成的報道[37],而類骨磷灰石層的形成通常被認(rèn)為是誘導(dǎo)骨形成的起始[10],這就使得體內(nèi)外實驗結(jié)果發(fā)生了矛盾。而本研究結(jié)果則提示體內(nèi)生理應(yīng)力環(huán)境很可能不利于微孔隙率較低的HA材料植入后的礦化沉積,從而抑制了隨后的一系列細(xì)胞分化和組織形成過程,最終影響了骨形成的發(fā)生。此外,不同頻率的MVS應(yīng)力環(huán)境對HA礦化沉積的不同影響也可以用于解釋材料植入體內(nèi)不同應(yīng)力部位后骨誘導(dǎo)行為的差異性。

2.5 MVS應(yīng)力環(huán)境下HA多孔支架的抗壓性能

抗壓試驗結(jié)果顯示(圖7),MVS應(yīng)力環(huán)境對HA多孔支架力學(xué)穩(wěn)定性沒有明顯影響。在40和60 Hz的MVS環(huán)境中浸泡7和14 d后,HA多孔支架的抗壓強度仍與初始強度相仿。這意味著微振動不會顯著影響HA多孔支架的抗壓強度。這可能是因為HA具有極低的體外降解速度,即使在 MVS應(yīng)力環(huán)境促進(jìn)其鈣離子釋放的情況下,材料的降解也是極其有限的。骨生物支架的降解行為對細(xì)胞長入、宿主反應(yīng)和組織再生有重要作用[10]。理想的支架降解速度應(yīng)與新生骨組織再生的速度相匹配。而骨形成是一個緩慢的過程,尤其是在支架植入初期,因此支架的力學(xué)穩(wěn)定性就成為再生修復(fù)成功的前期要素之一。雖然理論上植入物能發(fā)生更快的改建過程是一個優(yōu)點,但從臨床角度來看對改善修復(fù)失敗或是并發(fā)癥的發(fā)生并無明顯效果[10]。前述HA陶瓷生物活性體外評價實驗的結(jié)果已經(jīng)顯示在 MVS應(yīng)力環(huán)境下得到的評價結(jié)果可能更真實可靠,因此實驗證明MVS應(yīng)力環(huán)境不至于造成HA多孔支架的力學(xué)性能破壞,具有重要的臨床應(yīng)用指導(dǎo)意義。

圖7 微振動對HA多孔支架抗壓強度的影響Fig.7 Compressive strength of HA porous scaffold under static state,40 and 60 Hz vibration frequency incubated for 7 and 14 d

3 結(jié)論

本研究首次嘗試在體外構(gòu)建MVS應(yīng)力環(huán)境來模擬體內(nèi)生理應(yīng)力環(huán)境,從而得到更真實準(zhǔn)確的HA生物活性和力學(xué)穩(wěn)定性評價結(jié)果,這將有助于骨誘導(dǎo)性磷酸鈣陶瓷的設(shè)計和優(yōu)選,并為深入理解磷酸鈣陶瓷骨誘導(dǎo)機(jī)制提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

研究證實應(yīng)力環(huán)境是影響 HA陶瓷生物活性和骨誘導(dǎo)性的重要因素,并且這種力學(xué)因素與材料本身的理化因素共同作用于HA陶瓷的生物活性。在沒有影響HA支架抗壓性能的前提下,具有較高孔隙率HA材料的生物活性在中低頻MVS應(yīng)力環(huán)境中得到了明顯增強;但對于較低孔隙率的 HA材料,其在MVS應(yīng)力環(huán)境中生物活性有所降低。