閆顏 汪茜 秦寶麗

(中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院/遼寧省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，遼寧 沈陽 110042)

作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，結(jié)直腸癌是第三常見的導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的疾病[1]。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是一大類長度超過200個核苷酸的不具備編碼蛋白質(zhì)能力的RNA轉(zhuǎn)錄物。lncRNAs在包括炎癥、動脈硬化、自身免疫性疾病、腫瘤等多種疾病中均發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[2-3]。文獻(xiàn)[4-6]報道，包括分化拮抗非編碼RNA(DANCR)，肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(MALAT1)，漿細(xì)胞瘤易位變體1(PVT1)，非活性X特異性轉(zhuǎn)錄物(XIST)，轉(zhuǎn)化生長因子-β激活(ATB)等多個lncRNAs均參與到結(jié)直腸癌的包括增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等多種病理學(xué)過程中。目前關(guān)于長基因間非編碼RNA 483(LINC00483)在結(jié)直腸癌中表達(dá)及作用的報道極少。本研究將初步探討LINC00483在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)并研究其對結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29及LOVO細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料 收集3例2018年1月至2018年2月期間行結(jié)腸癌切除術(shù)中切取的新鮮結(jié)直腸癌組織及配對的癌旁組織標(biāo)本，所有標(biāo)本于切除后立即用液氮保存運(yùn)送并進(jìn)行相關(guān)檢測；同時收集67例2015年1月至2018年1月期間行結(jié)腸癌切除術(shù)患者的福爾馬林固定并石蠟包埋的(FFPE)結(jié)直腸癌組織及配對的癌旁組織標(biāo)本?；颊呔?jīng)病理學(xué)檢查證實診斷為結(jié)腸癌和或直腸癌?；颊吣?8例，女32例，年齡51～75歲，平均年齡64.3歲，所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。細(xì)胞系：人正常腸上皮細(xì)胞系NCM460和人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29及LOVO購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素購于上海寶曼生物科技有限公司；TRIzol及Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；QIAGEN FFPE RNeasy試劑盒購于德國QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購于德國Roche公司；Transwell小室購自美國Corning公司；特異性LINC00483探針、特異性LINC00483干擾寡核苷酸(siLINC00483-01和siLINC00483-02)及錯義對照寡核苷酸(siscramble，siSCR)均由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計合成；免疫原位雜交試劑盒購于美國BioChain公司；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3實驗方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人正常腸上皮細(xì)胞株NCM460及人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29和LOVO均接種于添加10% FBS、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)80%時，以0.25%胰蛋白酶消化并傳代。對于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，取生長狀態(tài)佳的HT29和LOVO細(xì)胞調(diào)整密度為2×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板中，24 h后，利用Lipofectamine2000將siSCR及siLINC00483-01或siLINC00483-02分別轉(zhuǎn)染至HT29和LOVO細(xì)胞中，具體操作嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行。48 h后進(jìn)行后續(xù)的qRT-PCR和transwell實驗。

1.3.2qRT-PCR檢測LINC00483的表達(dá) 參照Trizol說明書提取組織及細(xì)胞的總RNA并分組標(biāo)記；參照FFPE試劑盒說明書提取石蠟包埋的結(jié)腸癌及癌旁組織標(biāo)本的總RNA。取5 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以合成cDNA，反應(yīng)產(chǎn)物按實時熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)定GAPDH作為內(nèi)參，具體反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性15 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共45個循環(huán)。引物序列如下：LINC00483上游，5’-GCTGAACCGGAACAGGACAT -3’，LINC00483下游5’-CCAGTTCACAGCAACTCACG-3’；GAPDH上游 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3’，GAPDH下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。采用2-ΔΔCt法計算LINC00483的表達(dá)并分別與各自的對照組(Paratumor組、NCM460組及siSCR組)比較并計算LINC00483的相對表達(dá)量。

1.3.3免疫原位雜交檢測LINC00483表達(dá)[7]將新鮮的結(jié)腸癌組織切片置于0.5% Triton X-100的1×PBS清洗液中清洗透膜，并置入含有1% 封閉液及LINC00483特異性探針的雜交液的濕盒中，將濕盒置入37 ℃孵箱中孵育過夜。次日分別用含有4×、2×及1×的0.1% Tween-20的檸檬酸鈉緩沖溶液依次清洗切片3次，5 min/次。室溫PBS清洗3次，DAPI復(fù)染，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3.4Transwell實驗檢測HT29及LOVO細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力[7]常規(guī)包被底部膜，水化，對于侵襲實驗，采用Matrigel凝膠包被上室基膜。將分別轉(zhuǎn)染siSCR和siLINC00483-01/siLINC00483-02 48 h的HT29和LOVO細(xì)胞接種于Transwell上室內(nèi)，接種密度為5×104個/孔。在上室內(nèi)加入100 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，下室內(nèi)加入500 μL含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，并置于37 ℃、5% CO2的孵箱中孵育。48 h后取出Transwell小室，棉簽拭去Transwell小室內(nèi)部細(xì)胞，沖洗、固定、染色后倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。每組鋪6個Transwell 小室，取其平均值。

2 結(jié) 果

2.1LINC00483在結(jié)腸癌組織中表達(dá)增高 3例新鮮的結(jié)腸癌及癌旁組織采用免疫原位雜交檢測LINC00483的表達(dá)，見圖1a，相比于癌旁組織，LINC00483在結(jié)腸癌組織中表達(dá)明顯增高(***P<0.01)；同時，采用qRT-PCR法檢測了LINC00483在70例結(jié)腸癌標(biāo)本中的表達(dá)情況。見圖1b，相比于癌旁組織，LINC00483在絕大部分(94.29%，66/70)結(jié)腸癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織。

注：***P< 0.01。

圖1LINC00483在結(jié)腸癌組織中表達(dá)增高

2.2LINC00483在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)增高 結(jié)果顯示，與組織學(xué)水平的檢測結(jié)果相類似，相比于人腸正常上皮細(xì)胞系NCM460，LINC00483在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29及LOVO的表達(dá)明顯增高(***P<0.01)，見圖2。

注：***P< 0.01。

圖2qRT-PCR法檢測 LINC00483在結(jié)腸癌細(xì)胞系及正常腸上皮細(xì)胞系NCM460中的表達(dá)

2.3轉(zhuǎn)染LINC00483 siRNAs可抑制LINC00483的表達(dá) 見圖3，相比于轉(zhuǎn)染scramble siRNA(siSCR)組，轉(zhuǎn)染LINC00483 siRNAs(siLINC00483-01和siLINC00483-02)后，LINC00483在HT29及LOVO細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)均受到了明顯抑制(**P< 0.01)。

注：**P< 0.01。

圖3轉(zhuǎn)染LINC00483 siRNAs可抑制LINC00483在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.4下調(diào)LINC00483可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移 應(yīng)用Transwell實驗檢測下調(diào)LINC00483對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29及LOVO侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。見圖4，下調(diào)LINC00483明顯削弱了HT29及LOVO細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力(**P<0.01)。

圖4 下調(diào)LINC00483可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT29及LOVO侵襲轉(zhuǎn)移

3 討 論

lncRNAs是隸屬于非編碼RNA家族的一類長度超過200個堿基的長鏈大分子RNA轉(zhuǎn)錄物[8]。越來越多的證據(jù)表明LncRNAs廣泛參與修飾腫瘤的多個生物學(xué)行為過程，包括腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬、侵襲轉(zhuǎn)移等等[9-10]。LncRNAs可通過作為支架或向?qū)д{(diào)控蛋白與基因的相互作用，也可通過“海綿”的方式與微小RNA(miRNA)或蛋白相結(jié)合，還可作為增強(qiáng)子修飾其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[11-13]。一些矛盾表達(dá)的lncRNAs可通過作為癌基因或者抑癌基因的方式對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起到重要的調(diào)控作用[7，14]。

長基因間非編碼RNA 483(LINC00483)位于人染色體17q21.33，全長共825個堿基。目前有關(guān)LINC00483的相關(guān)報道極少。D.Li等[15]發(fā)現(xiàn)LINC00483在胃癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)增高，LINC00483可通過吸附內(nèi)源性抑癌基因miR-30a-3p的方式提升精子相關(guān)抗原9(SPAG9)的表達(dá)并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，LINC00483在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織；且其在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29及LOVO中的表達(dá)同樣高于人正常腸上皮細(xì)胞系NCM460。也就是說LINC00483在結(jié)直腸癌中的表達(dá)升高。

結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移尤其是肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的一個重要因素，Y.Wang等[7]研究報道，LncRNAs DANCR在結(jié)直腸癌中表達(dá)增高，DANCR可通過作為miR-577的競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)的方式調(diào)節(jié)熱休克蛋白27(HSP27)的表達(dá)并促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。Chen DL等研究發(fā)現(xiàn)，LncRNAs XIST在結(jié)直腸癌中表達(dá)增高，高表達(dá)的XIST與結(jié)直腸癌病人的不良預(yù)后密切相關(guān)，XIST可通過抑制miR-200b-3p的方式提高鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒1(ZEB1)的表達(dá)并促進(jìn)ZEB1介導(dǎo)的結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移[16]。本實驗首先通過RNAi的方式下調(diào)了LINC00483在HT29及LOVO細(xì)胞中的表達(dá)，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染LINC00483 siRNAs(siLINC00483-01和siLINC00483-02)后，HT29及LOVO細(xì)胞中LINC00483的表達(dá)明顯降低，證實轉(zhuǎn)染獲得了成功。進(jìn)一步通過Transwell實驗考察LINC00483對結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29及LOVO侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。本研究結(jié)果顯示，相比于轉(zhuǎn)染siSCR組，轉(zhuǎn)染siLINC00483組細(xì)胞的侵襲及遷移能力均明顯降低，也就是說下調(diào)LINC00483可明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29及LOVO侵襲轉(zhuǎn)移。

同其他多數(shù)惡性腫瘤一樣，結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程是一個多通路多因子共同作用的復(fù)雜的病理學(xué)過程。lncRNAs發(fā)揮作用的機(jī)制很多也較為復(fù)雜，其下游的分子眾多。本研究僅僅初步檢測了LINC00483在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況并初步探討了其對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。將進(jìn)一步的研究中深入探討LINC00483的具體作用機(jī)制并明確其可能調(diào)控或協(xié)同作用的靶分子，為分子靶向治療結(jié)直腸癌提供新思路。