楊龍斌，毛天驕，吳華健，焦安心，孫 裴，魏建忠，李 郁

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

豬鏈球菌病是豬的一種重要細(xì)菌性傳染病。能夠引起該病的鏈球菌種型繁多，不同種型之間生物學(xué)特性差異顯著，不同地區(qū)或年限優(yōu)勢(shì)種型也呈動(dòng)態(tài)過(guò)程[1]。豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)是引起豬鏈球菌病的主要病原，根據(jù)其莢膜多糖(CPS)抗原的不同，可分為35個(gè)血清型，其中1、2、7、9型為主要流行的血清型，且以2型SS(SS2)致病性最強(qiáng)，流行范圍最廣，危害最嚴(yán)重[2]。胞外因子(EF)、溶菌酶釋放蛋白(MRP)、溶血素(SLY)是SS重要的3種毒力因子，分別在逃避宿主免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡、侵入和裂解細(xì)胞及導(dǎo)致腦膜炎過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。腸球菌先前歸類(lèi)于鏈球菌科鏈球菌屬，后來(lái)發(fā)現(xiàn)腸球菌和鏈球菌的16S rRNA存在明顯區(qū)別，遂將其列為一個(gè)單獨(dú)的屬：腸球菌屬[4]。腸球菌一直被認(rèn)為是一類(lèi)對(duì)機(jī)體無(wú)害的共棲菌，但近年來(lái)的研究證明許多腸球菌也具有致病性，人感染腸球菌的報(bào)道已屢見(jiàn)不鮮，動(dòng)物感染腸球菌的報(bào)道也越來(lái)越多，且人與動(dòng)物存在交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)[5]。

本研究通過(guò)對(duì)江淮地區(qū)臨床病例中196株分離菌的鑒定，分析SS和腸球菌的血清型、毒力基因型、PFGE基因型及藥物敏感性，了解江淮地區(qū)SS和腸球菌的優(yōu)勢(shì)血清型、基因型以及分離菌株之間的聯(lián)系，為相關(guān)疫病防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品與主要實(shí)驗(yàn)材料 196株分離菌源自江淮地區(qū)豬源臨床病例，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病研究室分離、命名并保存。肺炎鏈球菌質(zhì)控菌株ATCC49619、金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株ATCC25923購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株H9812由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)；SS1、2、7、9型標(biāo)準(zhǔn)株由江蘇農(nóng)科院獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA-YE)、水解酪蛋白瓊脂(M-H，藥敏試驗(yàn)專用培養(yǎng)基)購(gòu)自紹興天恒生物科技有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、DNA Marker I、內(nèi)切酶SmaⅠ、XbaⅠ均購(gòu)自TaKaRa公司；20種藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；溶菌酶購(gòu)于Sigma公司；蛋白酶購(gòu)自德國(guó)Merck公司；PFGE級(jí)瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；SeaKem Gold Agarose購(gòu)自美國(guó)LONZA公司；全自動(dòng)微生物生化鑒定GPI卡購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考文獻(xiàn)[6]，針對(duì)SS菌株間保守的谷氨酸脫氫酶基因(gdh)設(shè)計(jì)其種屬鑒定引物；針對(duì)莢膜多糖基因cps1I(1型)、cps2J(2型)、cps7H(7型)和cps9H(9型)設(shè)計(jì)鑒定SS血清型引物；針對(duì)毒力因子(mrp、ef、sly)設(shè)計(jì)鑒定SS毒力基因引物(表1)。引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 分離菌中SS和腸球菌的鑒定

1.3.1 SS的鑒定參考文獻(xiàn)[7]中SS的鑒定方法，將196株分離菌分別接種于含5%血清的TSA培養(yǎng)基及兔鮮血瓊脂平板中培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài)及溶血性，并挑取表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、半透明的細(xì)小菌落進(jìn)行純化。顯微鏡下呈單個(gè)、成對(duì)、鏈狀排列的革蘭氏陽(yáng)性球菌經(jīng)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)檢測(cè)為陰性，可初步判定為鏈球菌。采用煮沸法[8]提取SS總DNA，并采用gdh種屬鑒定引物進(jìn)行細(xì)菌種屬判定。PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃1min、55℃1 min、72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.2 腸球菌的鑒定采用GPI革蘭氏陽(yáng)性菌鑒定卡進(jìn)行腸球菌鑒定。在配套的一次性塑料試管中加入3 m L 0.45%NaCl溶液，挑取增殖培養(yǎng)的196株分離菌菌落制備細(xì)菌懸液后調(diào)整濁度約為0.5麥?zhǔn)蠁挝?。參考儀器使用說(shuō)明及段達(dá)榮等[9]實(shí)驗(yàn)流程操作后查看并記錄鑒定結(jié)果。

表1 本實(shí)驗(yàn)用到的引物Table 1 Primers used in this experiment

1.4 SS血清型鑒定及毒力基因檢測(cè) 采用PCR方法對(duì)鑒定為SS陽(yáng)性的菌株進(jìn)行1、2、7、9血清型及ef、mrp、sly毒力基因的檢測(cè)[10]。

1.5 SS和腸球菌PFGE基因型分型 參照文獻(xiàn)[11]采用PFGE方法對(duì)SS和腸球菌基因型分型。

1.6 SS和腸球菌藥物敏感性試驗(yàn) SS以肺炎鏈球菌ATCC49619為質(zhì)控菌株，腸球菌以金黃色葡萄球菌ATCC25923為質(zhì)控菌株，采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)推薦的K-B紙片擴(kuò)散法及判定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)并判定SS和腸球菌菌株對(duì)20種藥物的敏感性。缺少動(dòng)物源細(xì)菌藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)的藥物，參照人用抗菌藥敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株SS和腸球菌的鑒定結(jié)果 采用SSgdh引物，經(jīng)PCR方法對(duì)分離菌株初步鑒定；采用全自動(dòng)細(xì)菌分析儀鑒定腸球菌。結(jié)果顯示，196株分離菌中，SS 112株，占57.1%，為優(yōu)勢(shì)菌株；腸球菌40株，占20.4%；其它球菌44株，占22.5%。在40株腸球菌中，屎腸球菌21株，占52.5%；其次為糞腸球菌7株，占17.5%；鉛黃腸球菌、鳥(niǎo)腸球菌各4株，占10.0%；其它腸球菌4株，占10.0%。表明SS是江淮地區(qū)豬鏈球菌病防控的重點(diǎn)，且腸球菌也成為豬細(xì)菌性疾病重要的致病菌。

2.2 SS 1、2、7、9血清型鑒定 采用cps引物經(jīng)PCR方法鑒定SS的血清型。在112株SS中，SS1 9株，占8.0%；SS2 44株，占39.3%；SS7型1株，占0.9%；無(wú)SS9型；其余58株未定型，占51.79%。表明在致病性較強(qiáng)的1、2、7、9型SS中，江淮地區(qū)以SS2型為優(yōu)勢(shì)血清型。

2.3 SSef、mrp、sly毒力基因檢測(cè)結(jié)果 采用毒力基因mrp、ef、sly的引物，經(jīng)PCR方法鑒定112株SS的毒力基因。結(jié)果顯示，ef、mrp、sly毒力基因的攜帶率分別為39.3%、36.6%、56.3%，ef-/mrp-/sly-基因型36株，占 32.1%，其次為ef+/mrp+/sly+基因型25株，占22.3%，優(yōu)勢(shì)毒力基因型為ef-/mrp-/sly-，顯示江淮地區(qū)SS可能存在其它重要的毒力基因。而SS2型ef、mrp、sly毒力基因攜帶率明顯高于整體SS的攜帶率，分別為75.0%、52.3%、88.6%，ef+/mrp+/sly+基因型19株，占43.2%，為優(yōu)勢(shì)毒力基因型，其次為ef+/mrp-/sly+基因型14株，占31.8%(表2)。表明SS2型較其它血清型致病性強(qiáng)可能與其ef、mrp、sly毒力因子攜帶率高有關(guān)。

2.4 SS PFGE基因型分型 SS菌株經(jīng)蛋白酶K、溶菌酶作用及限制性內(nèi)切酶消化后進(jìn)行SS PFGE分型。結(jié)果顯示，112株SS分為56個(gè)PFGE基因型，Ps28(18株，16.1%)和Ps27(14株，12.5%)為其優(yōu)勢(shì)PFGE基因型。44株SS2型分為11個(gè)PFGE基因型，Ps28(15株，34.1%)和Ps27(13株，29.5%)也是SS2型的優(yōu)勢(shì)PFGE基因型(圖1)。表明江淮地區(qū)SS基因型呈多態(tài)性，SS PFGE分型比血清學(xué)分型具有更高的區(qū)分度。

2.5 腸球菌PFGE基因型分型 40株腸球菌經(jīng)一系列酶處理后進(jìn)行腸球菌PFGE分型。結(jié)果顯示，40株腸球菌分為20個(gè)PFGE基因型，Pe12(9株，22.5%)和Pe7(7株，17.5%)為優(yōu)勢(shì)PFGE基因型。21株屎腸球菌分為9個(gè)PFGE基因型，Pe12(7株，33.3%)和Pe7(6株，28.6%)也為優(yōu)勢(shì)PFGE基因型(圖2)。表明江淮地區(qū)腸球菌基因型多樣化，部分菌株源于同一克隆系(如CZ13-2、HF14-11、AQ11-1)，親緣關(guān)系密切，且具有高度的相似性，但又位于不同分支，相互之間還存在一定的差異，提示這些菌株可能在傳播過(guò)程中存在遺傳變異。

表2 不同血清型SS的毒力基因型分布Table 2 Distribution of the virulence gene type of Streptococcus suis

圖1 SS PFGE基因型聚類(lèi)樹(shù)Fig.1 PFGE genotype of the S.suis isolates

圖2 腸球菌PFGE基因型聚類(lèi)樹(shù)Fig.2 PFGE genotype of Enterococcus

2.6 SS藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 用K-B法測(cè)定SS藥物敏感性，結(jié)果顯示SS對(duì)萬(wàn)古霉素、氨芐西林、阿莫西林、氧氟沙星、頭孢拉定的敏感率達(dá)50.0%以上，對(duì)四環(huán)素、磺胺甲基異惡唑、鏈霉素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素、阿奇霉素、復(fù)方新諾明耐藥率高達(dá)85.0%以上，對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、恩諾沙星、替考拉寧耐藥趨勢(shì)明顯，耐藥率已達(dá)到40%左右(表3)，耐8種以上藥物的96株，占85.7%。表明江淮地區(qū)SS耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，且耐藥譜越來(lái)越廣。

2.7 腸球菌藥物敏感性試驗(yàn) 用K-B法測(cè)定腸球菌藥物敏感性，結(jié)果顯示腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素、替考拉寧敏感率可達(dá)72.0%以上，對(duì)鏈霉素、復(fù)方新諾明、磺胺甲基異惡唑、慶大霉素、頭孢吡肟、四環(huán)素、阿奇霉素、頭孢曲松耐藥率高達(dá)85.0%以上(表4)。40株腸球菌均耐6種以上藥物，耐8種以上藥物38株，占95.0%，表明江淮地區(qū)腸球菌多重耐藥現(xiàn)象也很?chē)?yán)重。

表3 SS藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Antibiotics sensitivity of Streptococcus suis

表4 腸球菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of antibiotics sensitivity of Enterococcus

3 討論

目前，在世界范圍內(nèi)SS是豬鏈球菌病最主要的病原菌。本研究196株分離菌中，SS為優(yōu)勢(shì)致病菌，與Wei報(bào)道一致[14]，表明SS是江淮地區(qū)豬鏈球菌病防控的重點(diǎn)。SS血清型眾多，源自不同健康狀況豬體的SS優(yōu)勢(shì)血清型存在差異，本研究中源自患病豬的SS2型為優(yōu)勢(shì)血清型，與Li和Wisselink報(bào)道(源自患病豬)一致，而與張純萍等報(bào)道(源自健康豬)不同[15-16]。SS毒力因子分布存在區(qū)域性差異，江淮地區(qū)ef-/mrp-/sly-為優(yōu)勢(shì)毒力基因型，其次為ef+mrp+sly+，與Li和Fittipaldi的報(bào)道不同[15,17]。優(yōu)勢(shì)毒力基因型ef-/mrp-/sly-的3種毒力基因均為陰性，表明SS存在其它重要的毒力基因。Vecht等將源自患病豬、健康豬、患病人體的180株SS2型進(jìn)行仔豬感染性試驗(yàn)，結(jié)果表明MRP、EF與SS2型的致病性密切相關(guān)[18]；濮俊毅利用斑馬魚(yú)檢測(cè)mrp+/ef+型和mrp-/ef-型SS2型的致病力，結(jié)果表明同時(shí)具有MRP、EF毒力因子的SS2型一般為強(qiáng)致病力菌株[19]；Wei等對(duì)從中國(guó)多地區(qū)分離的407株SS進(jìn)行血清型及基因型鑒定，并對(duì)其中的SS2型主要毒力基因型進(jìn)行小鼠感染性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，ef+/mrp+/sly+型SS2型(占54%)一般為高毒力基因型[14]。本研究中，江淮地區(qū)SS2型分離株毒力基因ef、mrp、sly的攜帶率分別為75.0%、52.3%、88.6%，明顯高于SS的平均水平(39.3%、36.6%、56.3%)，且結(jié)合SS2型分離于患病豬的臨床特征，表明SS2型較其它血清型致病性強(qiáng)可能與其ef、mrp、sly毒力因子攜帶率高有關(guān)[17]?？梢?jiàn)ef+/mrp+/sly+型不僅是我國(guó)常見(jiàn)SS2型暴發(fā)流行的主要毒力基因型[14]，也是江淮地區(qū)常見(jiàn)SS2型優(yōu)勢(shì)毒力基因型。因此，在江淮地區(qū)應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)對(duì)常見(jiàn)SS2型的防控，尤其在疫苗的選用上應(yīng)有的放矢。

本研究采用細(xì)菌分子分型“金標(biāo)準(zhǔn)”的PFGE法，初步建立了江淮地區(qū)常及腸球菌PFGE數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)豬鏈球菌病及腸球菌病的防治具有重要意義。同一PFGE基因型常存在不同血清型、毒力基因型，表明SSPFGE基因型與血清型、毒力基因型無(wú)相關(guān)性。112株SS分為56個(gè)PFGE基因型，40株腸球菌分為20個(gè)PFGE基因型，表明SS和腸球菌基因型呈多態(tài)性；部分菌株(如 SSHB13-2、HF11-1、HF14-8；腸球菌CZ13-2、HF14-11、AQ11-1)源于同一克隆系，親源關(guān)系密切且具有高度的相似性，但位于不同小分支相互之間存在一定的差異，表明菌株可能在傳播過(guò)程中存在遺傳變異。因此，對(duì)SS2型和屎腸球菌優(yōu)勢(shì)PFGE基因型的監(jiān)控，能夠更好的為豬鏈球菌病的溯源和分子流行病學(xué)的研究提供科學(xué)依據(jù)。

近年來(lái)，SS耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，不同地區(qū)豬場(chǎng)使用的抗生素藥物存在差異，耐藥譜不盡相同。對(duì)四環(huán)素、磺胺甲基異惡唑、鏈霉素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素、阿奇霉素、復(fù)方新諾明耐藥率達(dá)85%以上，與這些抗生素在獸醫(yī)臨床應(yīng)用時(shí)間較長(zhǎng)和應(yīng)用普遍有關(guān)。頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、恩諾沙星是獸醫(yī)臨床治療豬鏈球菌病的常用藥，但SS也已經(jīng)對(duì)它們表現(xiàn)明顯的耐藥趨勢(shì)，這可能是目前江淮地區(qū)豬鏈球菌病治療效果不佳的重要原因。40株腸球菌的耐藥嚴(yán)重程度明顯高于人源腸球菌[20]，阿莫西林、氨芐西林是人醫(yī)臨床治療腸球菌的常用藥，在江淮地區(qū)豬源腸球菌中已出現(xiàn)50%以上的耐藥率，而動(dòng)物源與人源腸球菌存在交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)該引起足夠的重視，這對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和公共健康均具有重要意義。此外，江淮地區(qū)SS和腸球菌均對(duì)萬(wàn)古霉素較敏感，這與獸醫(yī)臨床限制使用萬(wàn)古霉素，沒(méi)有此類(lèi)抗生素選擇壓力有關(guān)。