徐 結(jié)，侯 曉，張雪婧，蒲萬(wàn)霞

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/新獸藥重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

奶牛乳房炎(Bovinemastitis)的防控一直都被公認(rèn)為是世界性難題，它不僅使牛的產(chǎn)奶量下降，還影響牛奶的品質(zhì)，嚴(yán)重影響奶牛的健康和生產(chǎn)性能，給乳源安全與公共衛(wèi)生帶來隱患，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。在奶牛乳房炎的病原中，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)一直均有較高的檢出率，是導(dǎo)致奶牛乳房炎的主要病原菌之一[2]。由于S.aureus所引起的感染較難控制，危害性大，傳播廣，而且其能夠產(chǎn)生多種致病因子，如腸毒素、血漿凝固酶、白細(xì)胞毒素、表皮剝脫毒素和溶血素等，這些致病因子還是引起奶牛乳房炎、人類尿路感染、心內(nèi)膜炎、敗血癥、腹膜炎、骨關(guān)節(jié)疾病等各種疾病的致病原因[3]。因此很有必要對(duì)S.aureus進(jìn)行準(zhǔn)確的致病因子檢測(cè)與分型研究，實(shí)時(shí)掌握其可能存在的流行特點(diǎn)，為臨床合理用藥和乳房炎的防控提供依據(jù)。

血漿凝固酶是S.aureus所特有的致病因子，能夠保護(hù)其免于機(jī)體吞噬細(xì)胞的清除作用，臨床上也常用來作為S.aureus的檢測(cè)標(biāo)識(shí)物[4]，而且是作為檢測(cè)致病性S.aureus的標(biāo)識(shí)物[5]。Goh等在研究S.aureus凝固酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，凝固酶編碼的凝固酶基因(Coa)在3'末端有一系列堿基重復(fù)序列，長(zhǎng)度約為81 bp，不同基因型的S.aureus中其重復(fù)序列的數(shù)目也不同，通過設(shè)計(jì)特異性引物PCR擴(kuò)增Coa基因，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小進(jìn)行基因分型；同時(shí)采用限制酶AluⅠ對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，由于其酶切位點(diǎn)的差異性，Coa基因3'末端重復(fù)序列的可變區(qū)顯示多態(tài)性，所以可以根據(jù)酶切片段的多態(tài)性來進(jìn)行二次分型，用來彌補(bǔ)Coa基因分型精準(zhǔn)度不足的缺點(diǎn)[6]。采用Coa基因分型可以很大程度上提高對(duì)S.aureus的檢測(cè)效率，而且該基因分型操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可以用于S.aureus的流行病學(xué)分析[7]。本研究首次對(duì)青海和甘肅地區(qū)35株奶牛乳房炎臨床分離的S.aureus進(jìn)行Coa基因分型與主要致病因子的檢測(cè)，并分析基因型與致病因子之間的關(guān)系，為奶牛乳房炎的防控提供可靠的流行病學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與主要試劑 本研究所用210份奶樣來自青海和甘肅地區(qū)的2個(gè)大型奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，其中青海地區(qū)96份奶樣，甘肅地區(qū)114份奶樣，利用滅菌采樣管采集乳樣，對(duì)奶牛的4個(gè)乳區(qū)及采樣人員手臂嚴(yán)格消毒，棄去前兩把奶，每頭牛采集2份樣品。Coa基因陽(yáng)性S.aureus標(biāo)準(zhǔn)菌株CVCC2246和Coa基因陰性表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC(B)2606購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

A luⅠ、蛋白酶K和LaTaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；溶菌酶(Lysostaphin)購(gòu)自Sigma公司；Mueller-Hinton肉湯與固體以及甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；生化鑒定微量發(fā)酵管購(gòu)自蘭州榮昌微生物試劑公司；腦心浸出液(BHI)培養(yǎng)基購(gòu)自北京賽百奧科技有限公司；瓊脂糖購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司；基因組提取試劑盒購(gòu)自天根(TIANGEN)生化科技有限公司。

1.2 細(xì)菌的分離鑒定 將采集的210份奶樣分別取100μL均勻涂布于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)22 h。挑取紅色菌落，接種于BHI液體培養(yǎng)基，然后劃線于MH固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。挑選菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)S.aureus特征相一致的菌株，進(jìn)行后續(xù)鑒定。

1.3 分離菌株Coa基因的PCR擴(kuò)增 采用倪春霞等[8]設(shè)計(jì)的特異性引物Coa F：5'-ACCACAAGGTA CTGAATCAACG-3'/Coa R：5'-TGCTTTCGATTGTTC GATGC-3'(由北京華大基因科技公司合成)，以提取的S.aureus的基因組為模板進(jìn)行Coa基因的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4Coa基因的AluI酶切分析 根據(jù)文獻(xiàn)[6]和限制酶說明書對(duì)S.aureus的分離株進(jìn)行AluⅠ酶切反應(yīng)。利用Coa基因多態(tài)性分型的區(qū)分系數(shù)[9](The numerical index of discrimination)對(duì)分離株的分型方法進(jìn)行評(píng)估，通過得到的數(shù)值來判定分型方法的區(qū)分力度。公式如下：

D=區(qū)分系數(shù)；N=分型的分離株總數(shù)；s=分型數(shù)；ni=i型中分離株的數(shù)量

1.5 分離菌株致病因子的檢測(cè) 以分離株的基因組DNA為模板，利用4種致病因子引物[10]對(duì)分離株進(jìn)行α溶血素基因、β溶血素基因、LuKF(白細(xì)胞毒素F基因)、LuKS(白細(xì)胞毒素S基因)PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌的分離與鑒定結(jié)果 通過分離培養(yǎng)、生化鑒定，結(jié)果210份奶樣中共分離得到35株S.aureus，其中甘肅地區(qū)共分離出22株S.aureus(22/114，19.3%)，青海地區(qū)共分離出13株S.aureus(13/96，13.5%)。表明，甘肅、青海兩地奶樣中S.aureus的分離率較低，且前者的分離率略高于后者。

2.2Coa基因的PCR擴(kuò)增與酶切分析結(jié)果 自Goh等發(fā)現(xiàn)Coa基因可以用于對(duì)S.aureus分型以來，由于Coa基因分型方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，費(fèi)用低，全世界許多地區(qū)均采用此方法對(duì)S.aureus的基因多態(tài)性進(jìn)行分型[6]。在我國(guó)，朱戰(zhàn)波等在2007年就首先對(duì)黑龍江奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)分離出來的26株S.aureus進(jìn)行了Coa基因分型[11]。本實(shí)驗(yàn)以分離株的基因組為模板，利用Coa基因引物進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。結(jié)果顯示，35株S.aureus共擴(kuò)增出5種PCR型(圖1)。除PCR 1型僅存在于甘肅地區(qū)外，其它4種PCR型在兩地均有檢出，片段長(zhǎng)度為800 bp的PCR 3型的分離株在兩地區(qū)的數(shù)量最多，是這兩個(gè)地區(qū)主要流行基因型，這表明可能由于這兩個(gè)地區(qū)相距較近，而且經(jīng)常性的交流與溝通，造成不同基因型S.aureus在兩個(gè)地區(qū)相互傳播。

圖1 Coa基因的PCR鑒定Fig.1 Identification of coagulase genotype by PCR

2.3Coa基因的AluⅠ酶切分析Coa基因擴(kuò)增的5種PCR型經(jīng)過A luⅠ消化后共得到了8種不同的型/亞型。PCR 2型有3種不同的酶切結(jié)果，即亞型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ(圖2)，其中亞型Ⅰ僅存在于甘肅地區(qū)，亞型Ⅱ僅存在于青海地區(qū)，亞型Ⅲ在兩地均存在；PCR 3型有2種不同的酶切結(jié)果，即亞型Ⅳ和Ⅴ，這兩種亞型在青海和甘肅地區(qū)均存在且分布最多。其余3種PCR型均分別僅有1種酶切結(jié)果，不分亞型。結(jié)果表明，青海和甘肅兩地區(qū)分離株P(guān)CR型的分布雖然有稍許差異，但在兩地區(qū)卻均廣泛分布。

圖2 Coa基因亞型的AluⅠ酶切鑒定Fig.2 Subtype identification of coagulase gene digested by AluⅠ

Coa基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)A luⅠ酶切出現(xiàn)了同種PCR型不同的酶切亞型，反應(yīng)了這兩個(gè)地區(qū)菌株流行具有頻繁和廣泛的特征，呈現(xiàn)出地方流行性的現(xiàn)象，這可能與地區(qū)的環(huán)境條件有關(guān)。其余PCR型均僅有一種酶切產(chǎn)物，只有一種亞型。本實(shí)驗(yàn)中35株S.aureus均能夠通過Coa基因進(jìn)行多態(tài)性分型，其分離株區(qū)分系數(shù)為0.821，這個(gè)數(shù)值超過80%，表明Coa基因分型的方法區(qū)分力度好，適合于S.aureus的基因分型。這一結(jié)果與Elizabete[12]的報(bào)道稍有不同，可能與S.aureus的地方流行性差異有關(guān)。

2.4 致病因子在基因型中的分布 以各S.aureus基因組為模板，PCR檢測(cè)其致病因子。結(jié)果顯示，LukS和α溶血素在所有的S.aureus中均存在，致病因子LukF和β溶血素檢出率也較高，分別是30株(85.7%)和31株(88.6%)，其中致病基因β溶血素在甘肅地區(qū)檢出率為95.5%(21/22)，青海地區(qū)檢出率為76.9%(10/13)，致病因子LukF在甘肅地區(qū)檢出率為91.0%(20/22)，青海地區(qū)檢出率為76.9%(10/13)。致病因子在青海和甘肅地區(qū)均主要存在于PCR 3型的Ⅳ和Ⅴ亞型中(表1)。表明，甘肅地區(qū)致病因子LukF和β溶血素的檢出率均高于青海地區(qū)，且各致病因子廣泛分布于各基因型的菌株中。

表1 S.aureaus致病因子與其各PCR型分布情況Table 1 The comparison between virulence and genetype of S.aureus

致病因子溶血素和白細(xì)胞毒素是大多數(shù)致病性葡萄球菌產(chǎn)生的能夠抵抗宿主免疫吞噬的，能夠增強(qiáng)病原菌入侵宿主細(xì)胞能力的活性物質(zhì)[13]。本研究顯示4種致病因子主要存在于S.aureusPCR 3型的流行菌株中，在其2種Coa基因亞型中均有分布，這一結(jié)果表明該4種致病因子可能在奶牛乳房炎的發(fā)病過程中起到重要的作用，甘肅地區(qū)葡萄球菌總的致病因子檢出率高于青海地區(qū)。

本研究結(jié)果顯示甘肅地區(qū)牛源S.aureus的分離率略高于青海地區(qū)，所有分離株均能夠擴(kuò)增出Coa基因片段，PCR 3型是青海和甘肅地區(qū)主要流行的基因型。35株S.aureus均含有致病因子LukS和α溶血素，致病因子LukF和β溶血素檢出率也很高。致病因子普遍存在于S.aureus中，這可能是該菌引起奶牛乳房炎的主要誘因，值得關(guān)注。