張鵬飛，王 印,2*，德西措姆，楊澤曉,2，姚學(xué)萍,2，羅 燕,2，廖倡宇,2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130；3.西藏昌都市左貢縣畜牧站，西藏 昌都 854499)

豪豬(Hystrix hodgsoni)屬嚙齒目、豪豬亞目、豪豬科，具有食用、藥用、觀賞價值，素有動物人參的美稱。我國頒布的《國家保護的有益的或者有重要經(jīng)濟、科學(xué)研究價值的陸生野生動物名錄》中將豪豬列為保護物種，禁止捕獵，可人工馴養(yǎng)繁殖。國民生活水平的提高和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化結(jié)構(gòu)的調(diào)整，極大地推動了豪豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

志賀菌屬細菌可以引起人獸細菌性痢疾，具有高度傳染性且死亡率較高。人和動物感染該菌后，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、水樣瀉，嚴重者可見神經(jīng)癥狀并伴肺炎、敗血癥[1]。該菌的感染對全球，特別是發(fā)展中國家的人群(尤其是兒童)造成了嚴重危害，志賀菌可感染的動物包括：獼猴[2]，牦牛[3]，牛[4]，雞[5]，羊[6]等，并且近幾年關(guān)于動物感染該菌的報道不斷增多。同時，志賀菌是繼沙門菌、大腸桿菌O157∶H7后的世界第三大食源性致病菌，造成嚴重的食品衛(wèi)生安全隱患。志賀菌分為痢疾志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、鮑氏志賀菌和福氏志賀菌4個血清群，我國流行菌株以福氏志賀菌為主。喹諾酮類藥物是治療菌痢的首選藥物，但近年來福氏志賀菌對該類抗生素的耐藥率不斷提高，耐藥性嚴重，給臨床治療帶來極大挑戰(zhàn)。對喹諾酮類藥物的耐藥性主要與該菌DNA促旋酶Ⅱ和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的喹諾酮耐藥決定區(qū)QRDR(Quinolone resistance-determining region)發(fā)生突變有關(guān)，此外相關(guān)耐藥機制還包括主動外排系統(tǒng)和質(zhì)粒介導(dǎo)[7]。

2018年4月，四川省某規(guī)模化豪豬養(yǎng)殖場發(fā)生腹瀉疫情，哺乳豪豬發(fā)病率達100%，死亡率50%以上；同時成年豪豬也出現(xiàn)發(fā)熱和腹瀉癥狀。剖檢死亡豪豬可見腸道水腫充血，腸系膜高度充血，腸內(nèi)黃色水樣內(nèi)容物；全身臟器不同程度出血，以肺臟尤為嚴重，根據(jù)臨床癥狀和剖檢病變初診為細菌性痢疾，并且據(jù)畜主陳述使用抗生素治療未取得明顯的效果。因此，為明確此次細菌性痢疾疫情發(fā)生與治療失敗的原因，本研究擬通過細菌分離純化、培養(yǎng)特性觀察、染色鏡檢、生化鑒定和16S rRNA基因克隆測序確定分離所得菌株，分析分離株致病力、測定其耐藥譜，并對分離株的喹諾酮耐藥基因進行了PCR檢測和測序分析。為豪豬養(yǎng)殖業(yè)和其它經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)中福氏志賀菌的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料樣品、實驗動物與主要試劑 3頭哺乳期病死豪豬來自四川省樂山市某規(guī)模化養(yǎng)殖場；SPF級昆明小鼠12只，體質(zhì)量為18 g～20 g，雌雄各半，購自成都達碩生物科技有限公司；胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、麥康凱(MAC)瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵(TSI)瓊脂培養(yǎng)基、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基(SS)購自成都萬科生物技術(shù)有限公司；抗菌藥物藥敏紙片、細菌微量生化反應(yīng)管購自杭州微生物試劑有限公司；pMD19-T(simple)載體購自TaKaRa公司；大腸桿菌 DH5α、2×TaqPCR Master MIX、DNA 分子量標準、細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成 參照文獻[8-9]設(shè)計細菌16S rRNA基因通用引物P1/P2、DNA促旋酶Ⅱ喹諾酮耐藥決定區(qū)(gyr A)、拓撲異構(gòu)酶Ⅳ喹諾酮耐藥決定區(qū)(parC)、質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因qnrA、qnrB、qnr S的PCR擴增引物P3～P12(表1)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，稀釋至10μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細菌的分離、純化及培養(yǎng)特性觀察 解剖死亡豪豬，無菌取肺臟組織、腸道內(nèi)容物分別劃線接種于Mac瓊脂培養(yǎng)基和SS瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后挑取2個以上可疑菌落分別接種TSI、葡萄糖半固體和營養(yǎng)瓊脂斜面各1管，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。疑似菌株經(jīng)純化后進行革蘭染色鏡檢。

1.4 分離菌的生化試驗 挑取純化后的單個菌落接種于細菌微量生化反應(yīng)管，于37℃培養(yǎng)24 h后，參考GB 4789.5-2012《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗志賀氏菌檢驗》判定結(jié)果。

表1 實驗用引物序列Table 1 Primer sequences used in this experiment

1.5 16S rRNA基因的擴增及序列分析 提取分離株基因組DNA進行PCR擴增，擴增體系50μL：2×TaqPCR Master 25.0μL，RNase-free H2O 20.0μL，上下游引物各1.5μL，基因組模板2.0μL。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃1 min，30個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的片段，由華大科技有限公司測序。

1.6 藥敏試驗 采用紙片擴散法進行藥敏試驗，參照CLSI標準判定試驗結(jié)果。

1.7 小鼠致病性試驗 利用無菌生理鹽水沖下過夜培養(yǎng)的菌落，菌液濃度調(diào)至1×108cfu/m L。12只小鼠隨機分為2組，實驗組小鼠腹腔注射0.2 m L菌液，對照組小鼠腹腔注射0.2m L生理鹽水。感染后連續(xù)觀察7 d，剖檢死亡小鼠，按照1.3進行細菌的分離鑒定。

1.8 喹諾酮耐藥基因的PCR檢測及序列分析 采用細菌基因組提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA作為模板，進行喹諾酮耐藥基因gyr A和par C的PCR檢測；挑取經(jīng)純化的菌落，溶于100μL RNase-free H2O，經(jīng)煮沸離心后，以上清液作為DNA模板，進行質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因qnr A、qnr B、qnr S的PCR檢測。反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃10 min。gyr A與par C基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的片段，由華大科技有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast對比分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離菌株生長特性及形態(tài)觀察 按照1.3操作從3頭病死豪豬體內(nèi)分別分離純化到1株革蘭陰性菌，3株分離菌株在MAC瓊脂培養(yǎng)基上生長為粉紅色、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊的中等大小菌落；在SS瓊脂培養(yǎng)基上為無色菌落；在TSI中斜面產(chǎn)堿(紅色)、底層產(chǎn)酸(黃色)、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S、在葡萄糖半固體培養(yǎng)基中無動力。表明3株分離菌發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵乳糖和蔗糖，表現(xiàn)出相同的培養(yǎng)特性，結(jié)合上述結(jié)果初步判定分離菌株應(yīng)屬埃希菌屬、志賀菌屬或沙門菌屬其中之一。

2.2 生化特性鑒定 生化鑒定結(jié)果顯示，3株分離菌不能分解尿素、水楊苷、七葉苷、甘油，β-半乳糖苷酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶試驗陰性，可發(fā)酵棉子糖和甘露醇，遲緩發(fā)酵靛基質(zhì)。參考GB 4789.5-2012《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗志賀氏菌檢驗》分析，3株分離菌均符合福氏志賀菌的生化特性。

2.3 16S rRNA基因的擴增與序列分析 通用引物P1/P2分別擴增3株分離菌16S rRNA基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，均在約1 500 bp處有一特異性條帶。測序結(jié)果經(jīng)Blast比對分析，顯示3株分離菌的16S rRNA基因序列一致性為99%，并且與福氏志賀菌的16S rRNA基因序列同源性為99%，結(jié)合培養(yǎng)、染色特性和生化特性鑒定結(jié)果判定分離菌株為福氏志賀菌，在肺臟和腸道樣品中均有存在，確定此次豪豬腹瀉疫情由該菌感染所致。推測該菌的致病過程，可能為：細菌在腸道定植后，穿過消化道黏膜(通過胞吞或穿過細胞間隙)隨血流分布到腸道外各器官，引發(fā)全身感染，患病豪豬最終死于脫水導(dǎo)致的代謝性酸中毒和敗血癥。

2.4 藥敏試驗結(jié)果 藥敏試驗結(jié)果顯示，在所測試的藥物中，分離菌株僅對丁胺卡那敏感，對其它所測抗生素均表現(xiàn)為耐藥(表2)。這與臨床使用喹諾酮類等抗生素無法控制疫情的情況相符合。

2.5 小鼠致病性試驗 小鼠隨機分為2組，實驗組小鼠腹腔注射分離菌株純培養(yǎng)物，對照組注射生理鹽水，連續(xù)觀察7 d。實驗組小鼠在感染6 h后，開始表現(xiàn)精神不振、被毛粗亂，采食和飲水量均有下降，在感染24 h內(nèi)全部死亡。剖檢死亡小鼠可見，肺臟和肝臟出血，腸道水腫充血。從死亡小鼠病變組織分離所得菌株，經(jīng)革蘭染色鏡檢、培養(yǎng)特性觀察、生化試驗鑒定和16S rRNA基因序列測序分析，確定為福氏志賀菌，且各項試驗結(jié)果與豪豬病變組織中分離得到的菌株一致。對照組小鼠未見發(fā)病或死亡。

表2 分離株藥敏試驗結(jié)果Table 2 Antimicrobial susceptible tests of the isolate

2.6 喹諾酮耐藥基因的PCR檢測及測序分析 采用特異性引物分別擴增分離菌株喹諾酮耐藥基因gyr A、par C、qnr S、qnr B、qnr A。結(jié)果顯示，gyr A、par C、qnr S、qnr A基因擴增均為陽性，分別約為 300 bp、400 bp、550 bp、600 bp；qnr B基因擴增陰性(圖1)。將gyr A、par C基因測序結(jié)果分別與喹諾酮類抗生素大腸桿菌敏感株的gyr A(X06744)、par C(M 58408)基因序列進行比對。結(jié)果顯示，分離菌株gyr A基因存在C→T導(dǎo)致的83位TCG(Ser)→TTG(Leu)的突變；G→A導(dǎo)致的87位GAC(Asp)→AAC(Asn)的突變；85位 GTC→GTT、91位CGC→CGT、100位TAT→TAC導(dǎo)致的沉默突變。分離菌株par C基因存在G→T導(dǎo)致的58位AGC(Ser)→ATC(Ile)的突變；69位 CAA→CAG導(dǎo)致的沉默突變。

圖1 分離株喹諾酮耐藥基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 Amplification for quinolone resistance gene of the isolate by PCR

喹諾酮類抗生素是目前治療菌痢的首選藥物，該類藥物通過作用于細菌的拓撲異構(gòu)酶Ⅱ和Ⅳ，干擾細菌DNA復(fù)制、修復(fù)及轉(zhuǎn)錄而殺菌。但多年的臨床應(yīng)用導(dǎo)致志賀菌對喹諾酮類藥物的耐藥性日益嚴重，耐藥機制主要包括：1)拓撲異構(gòu)酶(Ⅱ和Ⅳ)突變；2)細胞膜孔蛋白通道改變或缺失；3)主動外排系統(tǒng)；4)質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥等。其中，拓撲異構(gòu)酶(Ⅱ和Ⅳ)突變是導(dǎo)致細菌耐藥性增強的主要原因，拓撲異構(gòu)酶Ⅱ(DNA促旋酶Ⅱ)的gyr A和gyr B兩個亞單位是藥物作用的主要靶點。在福氏志賀菌中，gyrA的突變位點集中于83位、87位、137位和211位。拓撲異構(gòu)酶Ⅳ也由par C和par E兩個亞單位組成，par C的突變位點集中于58位、129位、131位、134位、141位和151位[10]。本研究所得分離菌株gyr A的83位、87位和par C的58位存在突變。靶位點的突變會導(dǎo)致藥物不能結(jié)合DNA復(fù)合體而抑制超螺旋結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，因此也無法阻止mRNA結(jié)合和氨基酸合成。par C基因的突變需要在gyr A基因突變的基礎(chǔ)上才有可能產(chǎn)生，兩者的協(xié)同作用會提高菌株的耐藥性，是目前認為福氏志賀菌對喹諾酮類藥物耐藥的根本因素。此外，分離菌株還攜帶有qnr A和qnr S兩種質(zhì)粒，其存在可以保護拓撲異構(gòu)酶免受喹諾酮類藥物的攻擊，使細菌進一步產(chǎn)生更高水平的耐藥[7]。靶位酶突變以及質(zhì)粒介導(dǎo)所導(dǎo)致分離菌株對喹諾酮類藥物的耐藥，應(yīng)該是使用該類藥物無法控制該次疫情的根本原因。

本研究是國內(nèi)首次關(guān)于豪豬源福氏志賀菌病的報道，為豪豬養(yǎng)殖業(yè)和其它經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)中福氏志賀菌的防控及該菌耐藥機制的相關(guān)研究提供了參考。