吳春霞，盧建遠(yuǎn)，金素鈺，黃 林，鄭玉才

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

貓冠狀病毒(Feline coronavirus，F(xiàn)CoV)屬于冠狀病毒亞科α-冠狀病毒屬[1]，其基因組兩個大的開放閱讀框ORF1a和1b(占基因組2/3)與復(fù)制有關(guān)；ORF2、4、5和6分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白S、E、M和N[2]；ORF3和7分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白3a、3b和3c以及7a 和 7b[3]。

FCoV分為貓腸道冠狀病毒(Feline enteric coronavirus，F(xiàn)ECV)和貓傳染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV)[4]。FECV在貓中普遍存在，并在其腸上皮細(xì)胞中復(fù)制，感染呈無癥狀或輕微的腸炎。感染FCoV后大約有5%～10%的2歲以下貓發(fā)展成貓傳染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis，F(xiàn)IP)。研究表明，F(xiàn)IPV由FECV突變而來，它能夠在巨噬細(xì)胞中高效復(fù)制，是導(dǎo)致家貓死亡的主要病毒[5]。

FCoV研究中最重要的問題之一是FCoV與FIPV之間的關(guān)聯(lián)尚不清楚。序列分析表明，F(xiàn)IP患貓的ORF 3c基因常出現(xiàn)截短[6]，而7b基因是FCoV的毒力基因，完整的3c基因可以阻止7b基因編碼的毒力[7]。另外，S基因融合肽區(qū)的1045位氨基酸是鑒別FIPV的研究熱點(diǎn)，該區(qū)包含了病毒侵入時病毒與細(xì)胞膜融合的關(guān)鍵成分[8]。FCoV基因組序列變異很大[3]，但相關(guān)研究國內(nèi)很少。為了檢測其序列特征進(jìn)而尋找其致病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，本研究對來自成都地區(qū)的11只FIP患貓的腹水樣品進(jìn)行了FCoV非結(jié)構(gòu)蛋白基因和S基因七肽重復(fù)區(qū)(Heptad repeat region，HR)1序列的研究。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源 11例腹水取自西南民族大學(xué)動物醫(yī)院2017年9月～2018年3月接診的有腹部積液、黃疸等FIP癥狀的貓，樣品于-80℃保存。11只貓均在1歲以下。利用文獻(xiàn)中發(fā)表的檢測FIPV的引物[1]證實11例樣品為FIPV陽性。

1.2 主要試劑 PureLinkTMViral RNA/DNA mini Kit和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；MIX Green酶購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.3 RNA的提取及cDNA的合成 參照PureLinkTMViral RNA/DNA mini Kit說明書，提取貓腹水中總RNA，按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書方法反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

1.4 ORF3、7b以及S基因HR1序列的擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[1]合成PCR引物，以1.3獲得cDNA為模板利用套式PCR擴(kuò)增ORF3。7b基因[3]及S基因HR1序列[1]采用普通PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件與第一輪擴(kuò)增ORF3類似，只是采用相應(yīng)的引物和退火溫度。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR陽性產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果利用BLAST和DNAMAN(V6版)軟件分析。利用MEGA7軟件，參照GenBank中相關(guān)基因序列(EU186072等)建立進(jìn)化樹，分析不同腹水樣品檢測到的病毒基因的遺傳變異。

2 結(jié)果與討論

2.1 FIPV部分基因的擴(kuò)增結(jié)果 利用PCR對FIRV ORF3、7b和S基因HR1區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增出特異性的目的片段，大小與預(yù)期相符(圖1)。11個樣品全部擴(kuò)增得到7b基因和S基因HR1序列片段，9個樣品擴(kuò)增得到ORF3基因。未能擴(kuò)增到ORF3的兩個樣品可能是由于突變過高導(dǎo)致引物不適用引起。

圖1 FIPV ORF3、ORF7b及S基因HR1區(qū)域 的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplifications of ORF 3,ORF 7b and HR1 of S gene of FIPV by PCR

2.2 ORF3的序列分析 與參考株(EU186072)序列比對，擴(kuò)增得到的FIPV的ORF3a由于核苷酸缺失，導(dǎo)致9個樣品中FIPV均存在1個Phe缺失；9個樣品病毒的ORF3b基因的核苷酸存在突變，但不引起編碼氨基酸數(shù)量(72aa)的改變；ORF3c由于核苷酸缺失，導(dǎo)致推導(dǎo)氨基酸不同程度截短(13aa～130aa)，僅1個樣品(FIPV/SWU-CD-11/2018)的FIPV顯示具有完整的3c基因(表1)，ORF3C出現(xiàn)截短的比例約為89%(8/9只貓)。

FCoV本身是否直接導(dǎo)致FIP目前尚不清楚。有報道顯示，完整的3c基因是FCoV在腸道中有效復(fù)制的關(guān)鍵，但對FIPV的復(fù)制不重要[9]。本研究中高比例樣品的3c基因存在氨基酸的截短，正是由于這一改變，使得僅在腸道復(fù)制的FCoV脫離腸道，在巨噬細(xì)胞中復(fù)制并傳播，從而使貓出現(xiàn)致死性的FIP[1]。

表1 FIPV 3c基因序列的變化Table 1 Variation of FIPV 3c gene sequence

2.3 7b基因的序列分析 將11個樣品擴(kuò)增得到的FIPV 7b基因與參考株(EU186072)的相應(yīng)基因核苷酸和氨基酸序列比對后顯示，7b基因與參考株的核苷酸同源性為88.73%～91.30%，推導(dǎo)氨基酸序列同源性為85.44%～90.78%，突變位點(diǎn)有13～30個。3只貓在肽鏈N-末端附近缺失1個氨基酸。所有樣品在7個位點(diǎn)(第33、63、64、76、139、157和189位)出現(xiàn)氨基酸的全部替換，而其它突變位點(diǎn)僅少數(shù)氨基酸變化，這與FCoV的高突變率有關(guān)。

根據(jù)獲得的7b基因序列和GenBank中幾個FIPV的7b基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2A)，其中FIPV/SWU-CD-2/2018、FIPV/SWU-CD-3/2018 和 FIPV/SWU-CD-4/2018處于同一遺傳進(jìn)化分支，并與Hungary FIPV JQ40891和UK FIPV FJ943764親緣關(guān)系最近。FIPV/SWU-CD-5/2018自成一小分支，與UK FIPV FJ943764和Germany FIPV KJ665801親緣關(guān)系最近。所有的基因序列均處于同一大的遺傳進(jìn)化分支，表明本實驗所得的7b基因序列與國外報道的相應(yīng)基因序列的親緣性較高。

研究指出，F(xiàn)CoV的毒力由3c和7b基因互作決定[10]。完整的3c基因可以抑制7b基因編碼的毒力[9]，本實驗中91.67%的FIPV 7b基因完整，而89%FIPV的3c基因截短，推測二者共同作用提高了FCoV的毒力，導(dǎo)致貓患FIP。

2.4 S基因HR1序列的分析 與參考株(EU186072)S基因HR1序列比對顯示，本研究中1只貓的FIPV S基因HR1序列在末端缺失了7aa，其原因尚不清楚，也未見類似報道，其余10只貓F(tuán)IPV S基因HR1區(qū)域序列完整。本實驗所得S基因HR1序列與參考株的相應(yīng)核苷酸相似性為85.93%～89.51%，氨基酸相似性為92.48%～97.37%。所有樣本獲得的FIRV S基因HR1氨基酸序列，存在32處差異，單只貓的FIPV S基因HR1氨基酸序列最多有20處，最少有7處存在差異。幾個位點(diǎn)存在氨基酸的完全替換，包括融合肽內(nèi)的1045位Met與Leu的完全替換。融合肽包含了病毒入侵時病毒與細(xì)胞膜融合的關(guān)鍵成分，其氨基酸替換使病毒突變?yōu)槎拘孕问絒8]。

試驗所得序列和GenBank中的FIPV的S基因HR1序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2B)。FIPV/SWU-CD-2/2018、FIPV/SWU-CD-6/2018 和 FIPV/SWU-CD-8/2018處于同一遺傳進(jìn)化分支，并與Japan FIPV AB088223親緣關(guān)系最近，且與FIPV/SWU-CD-3/2018處于同一小分支。FIPV/SWU-CD-9/2018、FIPV/SWU-CD-10/2018自成一小分支，分別與Germany FIPV EU186072和UK FIPV DQ010921親緣關(guān)系最近。所有FIPV S基因HR1序列均處于同一大的遺傳進(jìn)化分支，表明本實驗所得FIPV S基因的HR1序列與國外報道的相應(yīng)基因序列的親緣性較高。相同實驗室提交的該序列相似度極高，因此本研究中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時，分別選取有代表性的國外提交的基因序列。利用2個基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹盡管不完全一致，但反應(yīng)的進(jìn)化關(guān)系總體相似。

目前在分子水平上FIPV與FCoV尚無明確的區(qū)別[11]。在Bankwolf等人的試驗中，9/12只FIP貓的S蛋白1045位Met被Leu替換[1]，在Chang等人的試驗中，92%的FIP患貓的S蛋白1045位Met被Leu替換[12]，本研究中該位點(diǎn)所有Met均被Leu替換。S蛋白在細(xì)胞進(jìn)入過程中起重要作用，負(fù)責(zé)受體附著和細(xì)胞膜融合，該區(qū)氨基酸的替換會導(dǎo)致病毒的嗜性改變，使病毒得以從腸道逃逸至巨噬細(xì)胞中復(fù)制，從而使貓患FIP[12]。

本研究結(jié)果表明，從FIP患貓分離所得的FIPV的ORF3、7b以及S基因HR1序列與國外報道的幾個FIPV相應(yīng)基因片段有較近的親緣關(guān)系，其非結(jié)構(gòu)蛋白基因編碼的氨基酸序列存在很大的個體間差異，3c基因普遍存在高比例的、不同程度的截短，而3a和3b基因主要表現(xiàn)為氨基酸突變；7b基因和S基因HR1序列中均有一些位點(diǎn)的氨基酸被一致性替換。推測3c基因的截短和7b及S基因某些氨基酸的替換會增強(qiáng)病毒的毒性而引起FIP。

圖2 FIPV 7b基因(A)和S基因HR1序列(B)的遺傳進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic trees based on 7b gene(A)and S gene HR1 sequences(B)of FIPV