呂園園 王曉玲 鄧于新 李毅 官志忠 齊曉嵐

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3鄭州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)

阿爾茨海默病(AD)已成為繼心腦血管疾病后威脅老年人健康的又一重要病種，且其死亡率的增長(zhǎng)率排在第1位〔1,2〕。盡管AD的發(fā)現(xiàn)已有百多年歷史，但目前來(lái)看其發(fā)病機(jī)制仍然不很清楚〔1～3〕。突觸，是兩個(gè)神經(jīng)元功能聯(lián)系及信息傳遞非常關(guān)鍵的結(jié)合點(diǎn)，在神經(jīng)元之間信息傳遞過(guò)程中起著十分重要的作用，是個(gè)體認(rèn)知功能及學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)。盡管 AD 的基本病理改變?yōu)槔夏臧?SP)及神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)的形成，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，突觸結(jié)構(gòu)和功能缺陷在AD相關(guān)記憶衰退中更早的發(fā)揮作用〔4～6〕。此外，AD 患者尸檢標(biāo)本的研究已經(jīng)證實(shí)，在AD的早期就已經(jīng)檢測(cè)到突觸的丟失， AD 患者腦內(nèi)多種突觸相關(guān)蛋白含量下降，突觸功能低下、丟失，其可導(dǎo)致神經(jīng)元之間的信號(hào)傳遞受到影響或者破壞，從而引起認(rèn)知功能障礙的發(fā)生〔7,8〕。因此，防止突觸丟失，維持突觸功能正常有可能是AD治療的主要方法之一〔9〕。α3神經(jīng)型尼古丁受體(nAChR)在大腦的學(xué)習(xí)、認(rèn)知及記憶等功能方面具有非常重要的作用，并且參與了多條信號(hào)途徑的調(diào)控。α3 nAChR主要分布于大腦的特定區(qū)域和脊髓，與神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞密切相關(guān)，在突觸功能的調(diào)控中起到一定作用。銜接蛋白(AP)180、發(fā)動(dòng)蛋白(DYN)1兩個(gè)蛋白是由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的并調(diào)控突觸囊泡內(nèi)吞功能的關(guān)鍵蛋白，在突觸功能的維持上起著非常重要的作用。本研究采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)α3 nAChR水平對(duì)AP180及DYN 1的影響，探討α3 nAChR神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制及在AD發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 SH-SY5Y源于ATCC公司； 胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))；細(xì)胞培養(yǎng)基用杜氏改良培養(yǎng)液(DMEM)高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、雙抗購(gòu)于HyClone公司；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent、Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)購(gòu)于Roche公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度定量試劑盒、提取RNA用的Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自Thermo公司(美國(guó))；鼠抗α3 nAChR單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)所標(biāo)記的抗鼠二抗、α3 nAChR shRNA Plasmid重組質(zhì)粒均購(gòu)自美國(guó)Santa公司；鼠抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自Abmart公司；鼠抗DYN1單克隆抗體購(gòu)于Gene Tex公司(美國(guó))；兔抗AP180多克隆抗體購(gòu)于Abcam公司(美國(guó))；HRP標(biāo)記的抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)的CST公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜、WB其他相關(guān)試劑購(gòu)于Amersham公司(美國(guó))；擴(kuò)增α3 nAChR、DYN1、AP180、β-actin引物由上海生工生物有限公司合成；其他常規(guī)試劑購(gòu)于Solarbio公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 SH-SY5Y用于10% FBS、1% 雙抗的高糖DMEM中培養(yǎng)，置于飽和濕度、5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%，形態(tài)良好后將其傳代至6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)50%～70%時(shí)，用轉(zhuǎn)染試劑X-treme GENE HP DNA，按質(zhì)粒：轉(zhuǎn)染試劑為1∶3的轉(zhuǎn)染條件，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA〔10〕，細(xì)胞總的分組分為對(duì)照組、空載質(zhì)粒組(control shRNA plasmid)和轉(zhuǎn)染組(α3 nAChR shRNA plasmid)。轉(zhuǎn)染6 h后更換含10%FBS及1% 雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞，測(cè)定α3 nAChR、DYN1和AP180 mRNA及蛋白水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3Real-time PCR 檢測(cè)α3 nAChR mRNA、DYN1、AP180 mRNA水平 用Trizol一步法，提取各對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后以cDNA為擴(kuò)增模板，進(jìn)行Real-time PCR。實(shí)驗(yàn)所用引物序列：α3 nAChR：上游引物：5′-accaccgcaggataaaaatct-3′、下游引物：5′-cactttggatggcttctttga-3′，片段長(zhǎng)度126 bp；DYN1：上游引物：5′-gtcaacaagaccgtgaggga-3′，下游引物：5′-tgatgtcgccgatgatgc-3′；片段長(zhǎng)度187 bp；AP180：上游引物：5′-ctggagcaggatttggaatg-3′，下游引物：5′-ggaggtttcttgggactctgac-3′；片段長(zhǎng)度172 bp；β-actin：上游引物：5′-tggcaccacaccttctacaatg-3′，下游引物：5′-tcatcttctcgcggttggc-3′；片段長(zhǎng)度103 bp。用 ABI Step One Plus 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀收集擴(kuò)增循環(huán)熒光信號(hào)，采用SDS2.1軟件，以β-actin 為內(nèi)參照，計(jì)算α3 nAChR、DYN1、AP180 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(RQ=2-△△Ct)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.4Western印跡法檢測(cè)α3 nAChR、 DYN1、AP180蛋白水平的表達(dá)情況 細(xì)胞處理后收集細(xì)胞并加入蛋白高效裂解液，冰上裂解3 h，12 000 r/min，離心15 min，上清即為所提取的細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度定量。Western印跡法檢測(cè)α3 nAChR、DYN1、AP180蛋白表達(dá)水平，然后用ImageJ軟件，進(jìn)行目的、內(nèi)參條帶灰度值分析，最后計(jì)算α3 nAChR、DYN1、AP180蛋白條帶、β-actin蛋白條帶之間分析灰度值的百分比。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，每次至少3個(gè)復(fù)孔。

1.5統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析，組與組之間的比較采用LSD-t法，如方差不齊時(shí)采用DunnettT3校正檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1α3 nAChR shRNA Plasmid轉(zhuǎn)染SH-SY5Y后α3 nAChR mRNA及蛋白的表達(dá)水平 SH-SY5Y轉(zhuǎn)染α3 nAChR shRNA Plasmid后α3 nAChR mRNA(0.23±0.040)和蛋白水平(32.63±6.440)分別降低了76%和67%，且與對(duì)照組(1.00±0.001，100.00±12.810)及空載組(0.99±0.110，93.28±9.660)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而空載質(zhì)粒組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2α3 nAChR基因下調(diào)后DYN1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平 與對(duì)照組(1.00±0.00，100.00±10.34)比較，轉(zhuǎn)染組DYN1 mRNA(0.57±0.06)及蛋白表達(dá)水平(55.08±8.99)明顯降低(P<0.01)，而空載質(zhì)粒組(0.94±0.08，93.56±12.22)與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3α3 nAChR基因下調(diào)后AP180 mRNA及蛋白的表達(dá)水平 與對(duì)照組(1.00±0.00，100.00±12.83)比較，轉(zhuǎn)染組AP180 mRNA(0.56±0.08)及蛋白表達(dá)水平(55.74±12.35)明顯降低(P<0.01)，而空載質(zhì)粒組(0.94±0.05，103.79±14.84)與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖1 SH-SY5Y轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞α3 nAChR蛋白表達(dá)水平

圖2 SH-SY5Y轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞DYN1蛋白表達(dá)水平

圖3 SH-SY5Y轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞AP180蛋白表達(dá)水平

3 討 論

nAChR〔11〕是一種非第2信使介導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)(配體)結(jié)合的離子通道，其主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)、外K+、Na+及Ca2+等離子的流動(dòng)。nAChR廣泛分布于神經(jīng)元的胞體、軸突及樹(shù)突〔12〕，與多種神經(jīng)遞質(zhì)包括乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、γ-氨基丁酸、谷氨酰胺和5-羥色胺的釋放、改變突觸可塑性、大腦學(xué)習(xí)記憶、智力發(fā)育和識(shí)別能力等腦功能有關(guān)。nAChR由α和β兩種亞單位構(gòu)成。不同的亞單位以不同的組合(五聚體)構(gòu)成不同的nAChR亞型，大量研究報(bào)道及課題組前期研究均發(fā)現(xiàn)〔13〕：AD 患者腦中膽堿能系統(tǒng)嚴(yán)重受損，腦組織中多個(gè)區(qū)域中nAChR水平降低，AD患者大腦AchR數(shù)目減少、密度降低。α3 nAChR是nAChRs家族的主要成員之一，在AD患者的腦組織中也發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量明顯降低〔14〕，提示了α3 nAChR可能在突觸功能調(diào)節(jié)中具有一定作用。

突觸囊泡與突觸前膜融合時(shí)，神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙，與突觸后膜上的受體結(jié)合完成信息的傳遞。突觸囊泡數(shù)量、功能的紊亂，會(huì)影響到神經(jīng)遞質(zhì)的翻譯及突觸信息的傳遞，進(jìn)而影響了突觸功能〔15〕。因此，維持突觸囊泡的穩(wěn)定對(duì)延緩AD的發(fā)生具有至關(guān)重要的作用。AP180是一種多功能蛋白，分布于突觸前神經(jīng)末端，在突觸囊泡再循環(huán)過(guò)程及維持突觸囊泡的大小中起著重要作用，能協(xié)助完成網(wǎng)格蛋白的包被，同時(shí)還能調(diào)節(jié)突觸囊泡中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放量〔16〕。DYN1是一種三磷酸鳥(niǎo)苷酶(GTPase)，它的相對(duì)分子量為95 kD，其主要分布在突觸前囊泡膜。當(dāng)突觸囊泡膜上網(wǎng)格蛋白被包被后，網(wǎng)格蛋白會(huì)受到DYN1的擠壓及剪切，使存于于突觸前膜上的突觸囊泡解離下來(lái)，為下一次神經(jīng)遞質(zhì)的釋放做好準(zhǔn)備，而其擁有的GTP酶的水解作用對(duì)于剪切的過(guò)程有促進(jìn)作用〔17〕。細(xì)胞中AP180和DYN1兩個(gè)蛋白的表達(dá)水平降低會(huì)減弱神經(jīng)細(xì)胞回收突觸囊泡的能力，并且導(dǎo)致突觸前末端不能提供足夠的神經(jīng)遞質(zhì)，從而導(dǎo)致突觸的正常生理功能受到嚴(yán)重影響。近年研究發(fā)現(xiàn)AP180和DYN1兩個(gè)蛋白在AD患者和模型鼠大腦組織中均有明顯降低〔18〕，這可能是其參與了突觸囊泡循環(huán)影響突觸功能有關(guān)。

本研究提示α3 nAChR與突觸蛋白密切相關(guān)，在突觸功能的發(fā)揮中起到十分重要的作用。