孫思茂， 李 浩， 王笑竹， 嚴(yán)曉銘綜述， 薛 群,2,3審校

腦卒中(Stroke)為腦血管疾病的主要臨床類型，以突然發(fā)病、迅速出現(xiàn)局限性或彌散性腦功能缺損為共同臨床特征，是目前導(dǎo)致人類死亡的第二原因，它與心臟病、惡性腫瘤構(gòu)成人類三大致死疾病。腦卒中包括缺血性腦卒中(ischemic stroke)和出血性腦卒中(hemorrhagic stroke)，在中國(guó)，70%～80%腦卒中為缺血性腦卒中，缺血性腦卒中治療的主要目標(biāo)是癥狀出現(xiàn)后盡快恢復(fù)血流，實(shí)現(xiàn)再通的兩種主要方法是靜脈溶栓治療和血管內(nèi)介入治療，而這兩種有效途徑均存在嚴(yán)格的治療時(shí)間窗(therapeutic time window，TTW)。對(duì)于出血性腦卒中而言，具體治療包括內(nèi)科保守治療及外科手術(shù)治療，良好的腦保護(hù)可有效降低死亡率[1]。數(shù)千種在動(dòng)物模型中測(cè)試有效的神經(jīng)保護(hù)藥物在臨床試驗(yàn)中卻失敗了[2]，因此，尋找治療腦卒中的替代療法迫在眉睫。

值得注意的是，一種新型治療手段-外泌體治療腦卒中已經(jīng)有相當(dāng)多的研究及報(bào)道，例如，MSCs來(lái)源的外泌體被發(fā)現(xiàn)在卒中促進(jìn)神經(jīng)血管重構(gòu)和神經(jīng)功能恢復(fù)的主要機(jī)制中發(fā)揮重要作用[3]。本文就外泌體對(duì)腦卒中特別是缺血性腦卒中的應(yīng)用及其可能的機(jī)制進(jìn)行綜述，并對(duì)其臨床應(yīng)用所面臨的問題及使其進(jìn)一步優(yōu)化的技術(shù)進(jìn)行探討。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞(Multipotent mesenchymal stromal cells，MSCs)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，是由骨髓、脂肪組織、皮膚、臍帶血和外周血以及其他器官共同獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞和祖細(xì)胞組成的異質(zhì)性亞群，具有高度自我更新能力與多向分化潛能，目前已應(yīng)用于臨床治療心肌損傷性疾病、神經(jīng)損傷性疾病(包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、外傷及卒中)等[4]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞扮演多個(gè)角色，他們可以分化成為多個(gè)譜系，可以參加組織細(xì)胞治療。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子(見圖1)，這些物質(zhì)可以影響其他細(xì)胞生成、減輕炎癥、增強(qiáng)祖細(xì)胞的增殖、改善組織修復(fù)和減輕感染。目前普遍認(rèn)為，MSCs通過旁分泌抑制炎癥、重組免疫細(xì)胞、激活內(nèi)源性修復(fù)途徑來(lái)治療疾病。然而，干細(xì)胞治療仍存在許多問題，干細(xì)胞自身存在著異常分化、免疫排斥、技術(shù)操作難度較大、潛伏著極大的生物安全和醫(yī)療隱患風(fēng)險(xiǎn)等，因此，干細(xì)胞移植治療在諸多疾病中的應(yīng)用的到了限制。最新研究表明，MSCs產(chǎn)生一種胞外的囊泡，這種囊泡攜帶mRNAs、miRNA和蛋白質(zhì)，通過傳遞這些物質(zhì)可以起到治療疾病的作用[5]。這些囊泡在先前用細(xì)胞本身測(cè)試的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)試。 值得注意的是，囊泡制劑的治療在許多情況下顯示出與MSCs移植治療非常相似的結(jié)果，同時(shí)避免了與細(xì)胞移植相關(guān)的許多風(fēng)險(xiǎn)。

2 外泌體(exosomes)

外泌體(exosomes)是細(xì)胞分泌的具有磷脂雙分子層的囊泡結(jié)構(gòu)，與其他直徑為100～1000 nm直接起源于細(xì)胞膜的胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)不同，外泌體起源于細(xì)胞的內(nèi)體系統(tǒng)。首先細(xì)胞膜內(nèi)陷形成初級(jí)內(nèi)體，內(nèi)體膜再次內(nèi)陷形成多個(gè)管腔內(nèi)泡(intraluminal vesicles，ILVs)，此時(shí)包含多個(gè)ILVs的內(nèi)體即次級(jí)內(nèi)體也叫做多泡體(muihivesicular body，MVB)[6]。MVB膜與細(xì)胞膜融合而釋放的直徑為30～100 nm的脂質(zhì)雙分子層囊泡即為外泌體(見圖2)。外泌體主要運(yùn)載內(nèi)源性蛋白、脂質(zhì)、核酸等物質(zhì)，通過靶細(xì)胞內(nèi)化、受體-配體間相互作用或脂質(zhì)膜融合在細(xì)胞間進(jìn)行傳遞[5～7]。

外泌體具有的脂質(zhì)雙分子層用于運(yùn)輸和保護(hù)腔內(nèi)的物質(zhì)免受細(xì)胞外環(huán)境的破壞，這種脂質(zhì)雙分子層表面還包含多糖和多聚糖，主要由多乳糖胺、α-2,3和α-2,6-唾液酸，甘露糖以及復(fù)雜多鏈肽聚糖。此外，脂質(zhì)雙分子層還包含各類蛋白，其中很多已被證實(shí)是外泌體特殊的生物標(biāo)記物。Keerthikumar等在外泌體中發(fā)現(xiàn)的CD9、CD81、CD63以及TSG101都可以用來(lái)區(qū)別外泌體及其他囊泡結(jié)構(gòu)[8]。

外泌體腔內(nèi)還包括各種物質(zhì)(如RNA、DNA、蛋白質(zhì)、肽和脂質(zhì)衍生物)： 2007年，Valadi等人首次證實(shí)外泌體內(nèi)存在RNA，包括mRNA、miRNA和一些非編碼RNA[9]。此外，外泌體還攜帶單鏈DNA、雙鏈DNA、擴(kuò)增的致癌基因序列、轉(zhuǎn)錄因子和線粒體DNA。外泌體也可以攜帶蛋白質(zhì)和多肽，Laura Otero-Ortega所在團(tuán)隊(duì)通過蛋白組分析，已經(jīng)在MSCs來(lái)源的外泌體中鑒定出2416種蛋白質(zhì)，它們?nèi)嫔婕胺肿诱{(diào)節(jié)、結(jié)合和催化功能[10]。此外，外泌體含有參與腦修復(fù)功能的蛋白質(zhì)，包括突觸傳遞、神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)分化、血管生成、神經(jīng)投射、突觸生長(zhǎng)等。同時(shí)，外泌體中還包含一系列與細(xì)胞類型無(wú)關(guān)的共同存在的蛋白質(zhì)(包括外泌體形成的調(diào)節(jié)蛋白)以及不同組織細(xì)胞所特有的特異性蛋白[11]。

除了RNA、DNA和蛋白質(zhì)外，外泌體還富含某些脂質(zhì)，主要是神經(jīng)酰胺、膽固醇、磷脂酰絲氨酸和鞘脂質(zhì)[11]。

3 缺血性腦卒中的病理生理學(xué)

缺血性腦卒中是腦梗死核心組織缺氧、缺糖所致[1,12]，發(fā)病后不久，由于缺乏ATP，能量生產(chǎn)中斷，鈉鉀泵不能維持細(xì)胞膜電位，這導(dǎo)致去極化和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加會(huì)引起活性氧、磷脂酶和蛋白酶的過量產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞死亡，引起炎癥及免疫反應(yīng)，進(jìn)一步破壞血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)[12]。

缺血性腦卒中病灶區(qū)可分為梗死核區(qū)和缺血半暗帶。缺血半暗帶位于梗死核心區(qū)和正常組織之間。雖然梗死核核心內(nèi)的腦細(xì)胞在最初幾分鐘內(nèi)受到了不可逆轉(zhuǎn)的損傷，但血流的恢復(fù)可以減輕細(xì)胞損傷和梗死進(jìn)展到缺血半暗帶，因此缺血半暗帶可以被挽救。血供恢復(fù)時(shí)間越短，缺血損傷越小，再灌注損傷的誘導(dǎo)機(jī)會(huì)越小。挽救缺血半暗帶是急性腦梗死治療的一個(gè)主要目的；而恢復(fù)缺血腦組織的供血以及對(duì)缺血腦組織實(shí)施保護(hù)是挽救缺血半暗帶的兩個(gè)基本治療途徑[13]。

4 MSCs來(lái)源外泌體在缺血性腦卒中治療和診斷中的發(fā)現(xiàn)

與腫瘤外泌體的研究相比，外泌體在腦卒中中的應(yīng)用研究較少，主要集中于MSCs來(lái)源的外泌體的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)修復(fù)作用，其可能存在的修復(fù)機(jī)制總結(jié)(見表1)。然而，由于缺乏對(duì)外泌體的嚴(yán)格定義，以及缺乏分離外泌體的有效和經(jīng)濟(jì)的方法，外泌體的研究受到了限制。

腦卒中過程按時(shí)間分為4個(gè)階段，即超急性期缺血性腦卒中(HIS,6 h內(nèi))；急性期缺血性腦卒中(AIS，第1～7天)；亞急性期缺血性腦卒中(SIS，第8～14天)；缺血性卒中恢復(fù)期(RIS，d>14)[1]。研究表明，外泌體中的miRNA在卒中的不同時(shí)期存在差異；SIS和RIS的血漿外泌體miR-21-5p水平高于對(duì)照組，HIS的miR-30a-5p水平明顯高于對(duì)照組，AIS(第1～ 3天)則低于對(duì)照組。血漿來(lái)源的外泌體miR-21-5p和miRNA-30a-5p聯(lián)合應(yīng)用有望成為診斷缺血性卒中和區(qū)分不同缺血性卒中分期的生物標(biāo)志物[18]。

5 外泌體在缺血性腦卒中診斷和治療中的應(yīng)用

5.1 外泌體與缺血性腦卒中診斷 外泌體攜帶了反映母體細(xì)胞起源和病理生理?xiàng)l件的核酸和蛋白質(zhì)，此外，與直接存在于血液中的miRNA相比，由于囊泡結(jié)構(gòu)的存在，外泌體miRNA受到保護(hù)不被降解，使得外泌體miRNA成為更有用的生物標(biāo)志物載體。外泌體在包括血液、血漿和血清在內(nèi)的所有體液中均存在，具有特異性，易于分離和分析，是一種有易得的診斷應(yīng)用的生物標(biāo)志物載體[19]。

不同缺血時(shí)間血漿外泌體rno-miR-122-5p和rno-miR-300-3p含量差異較大，可作為TIA的潛在生物標(biāo)志物。Li等人檢測(cè)了55名缺血性腦卒中患者和25名健康志愿者的外泌體；檢測(cè)miR- 422a和miR-125b-2-3p血漿外泌體水平，探討其在不同IS分期(急性期和亞急性期)的潛在預(yù)測(cè)價(jià)值。亞急性期血漿外泌體miR-422a和miR-125b-2-3p表達(dá)水平明顯降低，急性期miR-422a表達(dá)水平較對(duì)照組升高[20]。血漿來(lái)源的外泌體miR-21-5p和miRNA-30a-5p聯(lián)合應(yīng)用是診斷IS分期和鑒別缺血性卒中持續(xù)時(shí)間的一種有理論上十分可行的生物標(biāo)志物。急性缺血性腦卒中患者的外泌體miR-223、miR-9和miR-124明顯高于健康人，外泌體miR-223、miR-9和miR-124的表達(dá)與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評(píng)分呈正相關(guān)[21]。這意味著外泌體miR-223、miR-9和miR-124是診斷AIS和評(píng)估缺血性損傷程度的有潛力的生物標(biāo)志物。

5.2 MSCs和外泌體治療缺血性腦卒中 MSCs是一種多功能干細(xì)胞，具有分化成多種組織特異性細(xì)胞的能力，可從骨髓、胎盤、臍帶、臍血和脂肪組織中分離提取[4]。MSCs療法在腦卒中的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，除了用MSCs替代受損細(xì)胞外，MSCs還可以促進(jìn)神經(jīng)可塑性、血管生成和免疫調(diào)節(jié)作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓MSCs通過外泌體實(shí)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)。Doeppner等人將MSCs與局部腦缺血后給予小鼠的MSCs源性外泌體進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)MSCs和MSCs源性外泌體均能促進(jìn)缺血性腦卒中后28 d血管生成和長(zhǎng)期神經(jīng)保護(hù)改善[22]。

在急性缺血性腦卒中中，抑制自噬可改善缺氧缺血的炎癥作用。脂肪來(lái)源的干細(xì)胞分泌的外泌體(ADSC)含miR-30d-5p可抑制自噬介導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞向M1分化，從而預(yù)防腦損傷[23]。將有谷氨酸興奮毒性的皮質(zhì)神經(jīng)元與脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSC)共培養(yǎng)(AMSC-CM)，與未處理對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)細(xì)胞損傷減少，乳酸脫氫酶(LDH)釋放減少，凋亡細(xì)胞數(shù)量減少[24]。

此外，有研究表明，MSCs治療后，miR-133b水平升高，MSCs通過外泌體傳遞miR-133b從而調(diào)節(jié)神經(jīng)生長(zhǎng)。MSCs分泌的外泌體過表達(dá)的miR -133b通過刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞外泌體的二次分泌，可以更好地促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，增加神經(jīng)的可塑性[25]。富含miR-17-92的MSCs源性外泌體通過激活PI3K/Akt/mTOR/GSK-3b信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)和神經(jīng)可塑性[24]。

研究表明，MSCs主要通過分泌外泌體在神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)中發(fā)揮作用。然而，注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能導(dǎo)致血管閉塞，并始終存在腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。與細(xì)胞療法相反，外泌體無(wú)細(xì)胞療法堵塞血管的風(fēng)險(xiǎn)，外泌體本身可以穿過血腦屏障并被修飾[26]，MSCs來(lái)源的外泌體的特征總結(jié)(見表2)。盡管外泌體具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但如何在臨床安全有效地應(yīng)用外泌體仍存在一些問題需要解決，如何大規(guī)模獲取外泌體，以及鑒別哪些外泌體具體神經(jīng)修復(fù)作用以及如何提高外泌體治療的靶向性亟待研究。

表1 MSCs來(lái)源的外泌體對(duì)腦卒中可能的治療機(jī)制

表2 MSCs來(lái)源的外泌體的特點(diǎn)

圖1 間充質(zhì)干細(xì)胞的分化與分泌圖譜

圖2 外泌體的形成過程

6 外泌體在腦卒中治療中的其他進(jìn)展

在腦卒中的藥理學(xué)治療中，藥物的安全性和有效給藥給病灶區(qū)仍存在問題。外泌體作為藥物載體具有免疫原性低、固有穩(wěn)定性好、傳遞效率高、能跨BBB等優(yōu)點(diǎn)[12]。然而，外泌體靶向能力的不足限制了其臨床應(yīng)用，一些研究人員對(duì)外泌體表面進(jìn)行了修飾，增加了外泌體的靶向能力。有報(bào)道表明通過將c(RGDyK)肽結(jié)合到外泌體表面后治療缺血性腦卒中，梗死區(qū)域的免疫抑制和抗凋亡作用均增強(qiáng)[29]。

外源性治療可通過MSCs來(lái)源的外泌體或miRNA放大內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)過程，達(dá)到腦卒中后神經(jīng)修復(fù)的作用。為了更有效地將miR-124傳遞到梗死部位，一些研究人員已經(jīng)以融合了狂犬病毒糖蛋白 (RVG)以及與溶酶體相關(guān)的糖蛋白2b (Lamp2b)從而對(duì)外泌體進(jìn)行修飾，發(fā)現(xiàn)修飾后的外泌體可以將基因藥物輸送到大腦起到治療作用[30]。來(lái)自人類心源性細(xì)胞(CDCs)的外泌體具有許多可能對(duì)治療急性缺血性腦卒中有益的特性，在兔的卒中模型中，栓塞后1 h靜脈注射CDCs源性外泌體可有效降低行為缺陷，且無(wú)顱內(nèi)出血危險(xiǎn)。

7 目前在治療方面的挑戰(zhàn)

由于人群的異質(zhì)性和卒中機(jī)制的復(fù)雜性，只有少數(shù)幾種藥理學(xué)藥物在臨床試驗(yàn)中獲得成功并廣泛適用于卒中患者的治療。MSCs來(lái)源的外泌體治療缺血性腦卒中雖然具有高度的可行性，但在應(yīng)用于臨床試驗(yàn)之前，仍有一些問題需要解決。首先，必須發(fā)展以低成本大規(guī)模獲得外泌體的技術(shù);其次，研發(fā)獲得可靠的高純度外泌體的分離技術(shù);第三，進(jìn)一步研究外泌體靶向藥物治療的準(zhǔn)確性。由于外泌體的生物學(xué)特性，外泌體可以被認(rèn)為是一種很有前景的藥物載體，它可以使藥物穿過甚至是完整的血腦屏障，到達(dá)梗死區(qū)域。外泌體作為一種外源性疾病治療的優(yōu)勢(shì)在于其低免疫原性、低毒性、低生物降解性和跨血腦屏障的能力。因此，為提高靶向藥物的準(zhǔn)確性，外泌體修飾值得人們深入地研究與開發(fā)。

8 小 結(jié)

來(lái)自不同組織來(lái)源的MSCs可增強(qiáng)腦卒中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷纳窠?jīng)功能恢復(fù)已被證明，盡管有這些發(fā)現(xiàn)，但在腦卒中急性期治療患者的困難性、MSCs移植治療的風(fēng)險(xiǎn)以及維持干細(xì)胞活躍狀態(tài)的高成本等限制了MSCs的使用。近年來(lái)，外泌體以其獨(dú)特的特性在腦卒中診斷和治療中的臨床應(yīng)用潛力引起了廣泛的關(guān)注。由于沒有足夠的臨床數(shù)據(jù)支持能將外泌體治療應(yīng)用于臨床，因此，外泌體的診斷及治療仍處于理論與實(shí)驗(yàn)階段。然而，隨著進(jìn)一步外泌體誘導(dǎo)的分子的研發(fā)以及臨床級(jí)外泌體的生產(chǎn)，外泌體應(yīng)用于臨床指日可待，必將促進(jìn)新的治療策略的發(fā)展，降低腦卒中死亡率，提高腦卒中患者的生活質(zhì)量。