管 萍, 劉文娟, 盧鵬超, 李志紅
腦血管病是一種常見的多發(fā)性疾病,死亡率和致殘率較高,近年來我國死亡原因中排名第二[1]。急性缺血性腦血管病占腦血管疾病的43%~65%,死亡率為15%~25%,嚴重危害人類健康[2]。雷洛昔芬是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑[3]。它是苯基唾液酚的合成非甾體衍生物,具有一定的組織特異性[4]。在生殖系統(tǒng)組織中,雷洛昔芬作為雌激素受體拮抗劑,可抑制乳腺和子宮腫瘤的生長,在生殖系統(tǒng)外的組織中起部分雌激素受體激動劑的作用,可以防止骨質(zhì)鈣流失和降低血清膽固醇水平[5]。
1.1 一般資料 選取體重在(240±20)g的雄性Wistar大鼠為研究。分為空白對照組、假手術組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組,每組10只大鼠。
1.2 實驗方法
1.2.1 建立大鼠大腦中動脈栓塞模型 腹腔注射3.5%水合氯醛(0.35 g/kg),麻醉后分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈結(jié)扎。在頸總動脈近頸內(nèi)外支切口處,通過切口將16 mm~17 mm長的尼龍繩插入頸總動脈內(nèi)結(jié)扎。完全插入大腦中動脈。注射尼龍線后,動物的右眼瞼下垂。動物在醒來后向左移動了一個圈,說明模型是成功的。假手術組頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈分離結(jié)扎[6]。
1.2.2 分組及給藥 將手術組隨機分成3組即雷洛昔芬低劑量組(10 mg/kg bw)、雷洛昔芬中劑量組(50 mg/kg bw)、雷洛昔芬高劑量組(100 mg/kg bw),每天灌胃不同劑量的雷洛昔芬溶液,正常對照組及假手術組每天灌胃等劑量的生理鹽水,自由進食,飼養(yǎng)30 d。
1.2.3 海馬組織分離及培養(yǎng) 處死大鼠前,用酒精棉球擦拭全身,初步消毒。再次浸泡在75%的酒精中,1 min后取出,打破頭部。將頭皮和頭骨切掉。打開大腦皮層,用眼鉗取雙側(cè)海馬,置于種植培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中。顯微鏡下,用顯微眼科鉗切除腦膜,切除海馬以外的腦組織。用DISGH溶液沖洗3次,用微眼剪(約1 mm)切斷海馬,加入0.125%胰蛋白酶溶液,在37 ℃培養(yǎng)箱中消化約20 min,加入與組織懸液等量的20%小牛血清培養(yǎng)基10 min,終止胰蛋白酶作用,添加10%胎牛血清和10%小牛血清的培養(yǎng)基,形成細胞懸浮液,細胞計數(shù)后,用DMEM溶液調(diào)節(jié)細胞密度至5×106,將細胞接種到培養(yǎng)皿中,5% CO2,95%空氣,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后通過MTT實驗測定其生長情況。
1.2.4 神經(jīng)元加鈣 取神經(jīng)上皮組織,制成細胞懸液,用無鎂BSS漂洗3次,加入含3 μmol Fluo-3/AM的無鎂BSS 1 ml在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。然后用Fluo-3/AM游離無鎂BSS代替原液,在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min,確保AM組在Fluo-3/AM細胞質(zhì)冷卻酶的作用下完全去除。
1.2.5 神經(jīng)元內(nèi)鈣含量測定 細胞內(nèi)鈣濃度與Fluo-3熒光強度成正比,因此細胞內(nèi)Fluo-3熒光強度代表細胞內(nèi)鈣濃度。激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)可實時檢測細胞內(nèi)Fluo-3熒光強度的變化。熒光-3熒光激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為530 nm,激光激發(fā)強度調(diào)節(jié)到最小。在此條件下,F(xiàn)luo-3本身的熒光猝滅在檢測時間(900 s)內(nèi)可以忽略不計。
1.2.6 神經(jīng)元活性的測定 通過MTT實驗對神經(jīng)元細胞的活性進行測定。取部分上述分離得到的細胞,利用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度至1×107個/ml,加到96孔板中,每孔100 μl,以等體積的完全培養(yǎng)基為調(diào)零孔,每組設6個復孔,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,向各孔加20 μl MTT溶液(5 mg/ml),培養(yǎng)4 h,棄上清,向各孔中加入150 μl DMSO,水平振動儀中快速震蕩10 min,在酶標儀上測定570 nm處吸光度值。
1.2.7 神經(jīng)元細胞凋亡測定 吸取5 μl Annexin V-FITC凋亡試劑于細胞中,混勻,室溫下避光孵育15 min,加入1×binding buffer,重懸細胞,1200 rpm,離心5 min,棄上清,加200 μl×binding buffer,重懸細胞,進行流式細胞儀檢測。流式軟件Flowjo 7.5 進行數(shù)據(jù)分析。
1.2.8 細胞中凋亡相關蛋白表達量的測定 采用Western blot 方法對細胞凋亡相關蛋白即caspase-3蛋白、Bcl-2蛋白及Apaf-1蛋白的表達情況進行測定,通過Image J軟件對條帶的灰度值進行測定,利用灰度值分析各蛋白的表達量。
1.2.9 細胞凋亡RNA表達量的測定 取大鼠血清,利用RT-PCR方法檢測血液中miRNA-21、miRNA-29因子的表達水平。利用總miRNA快速提取試劑盒提取總RNA,并使用miRNA特有的逆轉(zhuǎn)錄引物,將其與Super M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行反向轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄體系:(1)5×PrimeScript Buffer 4 μl;(2)1×PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μl;(3)Oligo dT Primer (50 μmol)1 μl (25 pmol);(4)Random 6 mers (100 μmol) 1 μl (50 pmol);(5)Total RNA 1 μl;RNase Free dH2O 12 μl 。RT-PCR在實時定量系統(tǒng)中上進行,擴增條件:(1)預變性:95 ℃時10 min;(2)變性:94 ℃時30 s、退火/延伸:60 ℃時1 min,兩個步驟40個循環(huán);(3)融解曲線分析:95 ℃時15 s、60 ℃時1 min、94 ℃時15 s和60 ℃時15 s。引物設計(見表1);反應體系(見表2)。
2.1 神經(jīng)元形態(tài)完整性分析 神經(jīng)元形態(tài)完整,胞體和突起清晰,胞體呈椎體或多角形,突起明顯。用大鼠特異性烯醇化酶(NSE)抗體鑒定培養(yǎng)細胞,表明神經(jīng)元(NSE陽性細胞)純度達95%(見圖1)。
2.2 神經(jīng)元鈣含量的測定 以3×104mol/L谷氨酸培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞1 min后,細胞內(nèi)鈣濃度迅速升高。大約95%的細胞有反應。用無鎂BSS洗滌2.5 min后,雷洛昔芬組,再次給予谷氨酸,治療前后谷氨酸誘導細胞內(nèi)鈣濃度升高。結(jié)果表明,不同濃度的雷洛昔芬可顯著降低谷氨酸誘導的細胞內(nèi)鈣的增加??瞻捉M、假手術組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組各組細胞的熒光強度分別為(230.2±10.3)、(233.5±11.3)、(342.3±12.4)、(302.5±14.5)、(312.3±13.5),5組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=160.033,P<0.001)。與空白對照組的熒光強度相比,假手術組無顯著變化(P>0.05),雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組熒光強度均顯著增加(P<0.001),但與雷洛昔芬低劑量組相比,雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組熒光強度均顯著降低(P<0.001)。
2.3 神經(jīng)元細胞活性及凋亡率測定 通過MTT實驗對神經(jīng)元細胞增殖能力進行測定,利用流式細胞儀對其凋亡率進行測定,實驗結(jié)果表明,空白組、假手術組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組各組細胞的增殖率分別為(0.68±0.02)、(0.66±0.02)、(0.21±0.01)、(0.59±0.03)、(0.54±0.04),5組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=534.265,P<0.001)。假手術組細胞增殖率與空白組相比無顯著性(P>0.05),雷洛昔芬組細胞增殖率均顯著低于空白組與假手術組(P<0.001),但與雷洛昔芬低價量組相比,雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率均顯著增加(P<0.001),且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率無顯著性差異(P>0.05)。細胞凋亡率結(jié)果表明,空白組、假手術組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組各組細胞的凋亡率分別為(1.1±0.03)、(1.2±0.02)、(10.38±0.23)、(8.92±0.12)、(9.01±0.21),5組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=9288.651,P<0.001)。假手術組細胞增殖率與空白組相比無顯著性(P>0.05),雷洛昔芬組細胞增殖率均顯著低于空白組與假手術組(P<0.001),但與雷洛昔芬低價量組相比,雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率均顯著增加(P<0.001),且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率無顯著性差異(P>0.05)。
2.4 細胞凋亡相關蛋白分析 用2-△△Ct法計算細胞中凋亡相關蛋白caspase-3、Apaf-1的相對表達量,5組比較差異有統(tǒng)計學意義(F1=38.328,F(xiàn)2=1151.204,P<0.001),結(jié)果(見圖2、表3)。 細胞凋亡率凋亡相關蛋白表明,假手術組細胞凋亡相關蛋白caspase-3、Apaf-1與空白組相比蛋白表達量有顯著性(P>0.05),雷洛昔芬組細胞caspase-3、Apaf-1蛋白均顯著低于空白組與假手術組(P<0.001),但與雷洛昔芬低價量組相比,雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞中caspase-3、Apaf-1蛋白均顯著增加(P<0.001),且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組caspase-3、Apaf-1蛋白表達量無顯著性差異(P>0.05)(見圖2)。
2.5 miRNA表達量的測定 通過RT-PCR實驗對神經(jīng)元細胞凋亡相關miRNA表達量進行測定,實驗結(jié)果表明,空白組、假手術組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組各組細胞的miRNA-21表達量分別為(0.14±0.01)、(0.16±0.01)、(0.32±0.02)、(0.21±0.01)、(0.22±0.01),5組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=306.250,P<0.001)。假手術組細胞miRNA-21表達量與空白組相比無顯著性(P>0.05),雷洛昔芬組細胞miRNA-21顯著高于空白組與假手術組(P<0.05),但與雷洛昔芬低價量組相比,雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率均顯著降低(P<0.001),且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞miRNA-21表達量無顯著性差異(P>0.05)。各組miRNA-29表達量分別為(0.17±0.02)、(0.19±0.01)、(0.43±0.03)、(0.31±0.02)、(0.32±0.02),5組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=256.364,P<0.001)。假手術組細胞miRNA-29表達量與空白組相比無顯著性(P>0.05),雷洛昔芬組細胞miRNA-29顯著高于空白組與假手術組(P<0.001),但與雷洛昔芬低價量組相比,雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞miRNA-29表達量均顯著降低(P<0.001),且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞miRNA-29表達量無顯著性差異(P>0.05)。
表1 引物設計
表2 反應體系
表3 神經(jīng)元細胞增殖能力、凋亡蛋白及相關miRNA表達量測定
A:空白組;B:假手術組;C:雷洛昔芬低劑量組;D:雷洛昔芬中劑量組;E:雷洛昔芬高劑量組,雷洛昔芬中、高劑量組熒光強度降低(P>0.05)
圖1 神經(jīng)元形態(tài)和神經(jīng)元鈣含量的測定
假手術組細胞凋亡相關蛋白caspase-3、Apaf-1與空白組相比蛋白表達量無統(tǒng)計學差異(P>0.05),雷洛昔芬組細胞caspase-3、Apaf-1蛋白低于空白組與假手術組(P<0.001),與雷洛昔芬低價量組相比,雷洛昔芬中、高劑量組細胞中caspase-3、Apaf-1蛋白增加(P<0.001)
圖2 細胞凋亡蛋白表達量的Western blot測定結(jié)果
雷洛昔芬在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用也引起了越來越多的關注[5]?,F(xiàn)有的一些體內(nèi)實驗結(jié)果表明,雷洛昔芬對氧化應激和β-淀粉樣蛋白所致的神經(jīng)損傷具有保護作用[7]。也有證據(jù)表明雷洛昔芬對中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺受體具有雌激素激動劑活性,提示雷洛昔芬可能作為雌激素激動劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)保護作用[8]。此外,雷洛昔芬神經(jīng)保護作用的細胞和分子機制尚不清楚。
有研究表明[9],雷洛昔芬能抑制過氧化應激所致的神經(jīng)元死亡,這種作用不是由經(jīng)典雌激素受體介導的。報道指出[10],雷洛昔芬對雌激素受體α誘導的神經(jīng)元凋亡有抑制作用,再生的作用還取決于經(jīng)典雌激素受體介導的。有報道指出[11],谷氨酸可直接激活細胞膜上配體激活的鈣通道,引起細胞膜膨脹Ca2+內(nèi)流,同時引起細胞膜去極化,激活電壓依賴性鈣通道,進一步引起鈣內(nèi)流和鈣超載[12]。本研究以3×104mol/L谷氨酸培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞,結(jié)果表明,不同濃度的雷洛昔芬可顯著降低谷氨酸誘導的細胞內(nèi)鈣的增加。與空白對照組的熒光強度相比,假手術組無顯著變化(P>0.05),雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組熒光強度均顯著增加(P<0.001),但與雷洛昔芬低劑量組相比,雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組熒光強度均顯著降低(P<0.001)。
在體內(nèi)動物實驗的結(jié)果表明[13],雷洛昔芬在腦缺氧缺血損傷的實驗模型中對神經(jīng)元具有明顯的保護作用,同時體外細胞研究也證實[14,15],雷洛昔芬在氧化應激、興奮毒性及β-淀粉樣蛋白引起的神經(jīng)元損傷中增加了神經(jīng)元的存活且對其具有保護作用。本研究表明,通過MTT實驗對神經(jīng)元細胞增殖能力進行測定,利用流式細胞儀對其凋亡率進行測定,實驗結(jié)果表明,雷洛昔芬組細胞增殖率與凋亡率均顯著低于空白組與假手術組(P<0.001),但與雷洛昔芬低價量組相比,雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率均顯著增加(P<0.001),且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率無顯著性差異(P>0.05)。
細胞中凋亡相關蛋白即caspase-3、Apaf-1的表達結(jié)果表明,假手術組細胞凋亡相關蛋白caspase-3、Apaf-1與空白組相比蛋白表達量無顯著性(P>0.05),雷洛昔芬組細胞caspase-3、Apaf-1蛋白均顯著低于空白組與假手術組(P<0.001),但與雷洛昔芬低價量組相比,雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞中caspase-3、Apaf-1蛋白均顯著增加(P<0.001),且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組caspase-3、Apaf-1蛋白表達量無顯著性差異(P>0.05)。與雷洛昔芬低價量組相比,雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞miRNA-21、miRNA-29表達量均顯著降低(P<0.001),且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞miRNA-21、miRNA-29表達量無顯著性差異(P>0.05)。
綜上所述:雷洛昔芬通過抑制神經(jīng)細胞凋亡蛋白caspase-3、Apaf-1及miRNA-21、miRNA-29的表達保護腦缺血大鼠腦細胞。