余薇薇 杜邦昊 張敏訥 萬巧玲 楊碩 趙晨菊

（1. 重慶交通大學(xué)河海學(xué)院 水利水運(yùn)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400074；2. 國(guó)家城市供水水質(zhì)監(jiān)測(cè)網(wǎng)重慶監(jiān)測(cè)站，重慶 400060）

近年來，內(nèi)分泌干擾物（Endocrine disrupting chemicals，EDCs）環(huán)境問題引起全球范圍的密切關(guān)注和重視，是國(guó)際環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域研究的前沿和熱點(diǎn)課題之一，美國(guó)、歐盟、日本、世界衛(wèi)生組織（WHO）、聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署（UNEP）、經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OCED）等國(guó)家和組織已制定管理法規(guī)和管控措施，中國(guó)也在《水污染防治行動(dòng)計(jì)劃》（國(guó)發(fā)［2015］17號(hào)）中提出嚴(yán)格控制環(huán)境激素類化學(xué)品污染并評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)施管控措施［1-3］。類固醇雌激素（Steroid estrogens，SEs）可分為天然和人工合成兩大類，是雌情活性最強(qiáng)、最受關(guān)注的一類EDCs，在環(huán)境中被廣泛檢測(cè)出，主要來源于城市污水處理廠和集約化畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)［4-7］。環(huán)境中極其微量的SEs便可強(qiáng)烈干擾人類和動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致發(fā)育、生殖、神經(jīng)、免疫等問題［1］，長(zhǎng)期暴露于高濃度SEs環(huán)境中還會(huì)導(dǎo)致魚類雌性化、雌雄同體、植物生長(zhǎng)損傷、微生物功能及群落多樣性變化等問題［8-9］，而且不同SEs間存在著復(fù)合毒性協(xié)同效應(yīng)，造成的危害更大［10］。酶具有催化效率高、活化能低、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等特點(diǎn)，被譽(yù)為“綠色催化劑”，在SEs的去除中起到重要作用并廣受關(guān)注［11-17］。本文總結(jié)了環(huán)境中酶對(duì)自由及結(jié)合態(tài)SEs的去除作用及其反應(yīng)機(jī)理，闡明不同形態(tài)SEs的主要酶降解、轉(zhuǎn)化路徑，并對(duì)酶在環(huán)境中SEs去除的應(yīng)用進(jìn)行了展望，以期對(duì)環(huán)境中兩種形態(tài)雌激素的酶降解轉(zhuǎn)化的研究提供理論借鑒。

1 環(huán)境中降解轉(zhuǎn)化SEs酶的基本性質(zhì)

環(huán)境中天然SEs可分為自由態(tài)（Free estrogens，F(xiàn)Es） 和 結(jié) 合 態(tài)（Conjugated estrogen，CEs）， 其結(jié)構(gòu)示意如圖1所示。天然SEs降解、轉(zhuǎn)化過程常用的酶主要分為兩大類：（1）氧化還原酶類（Oxidoreductases），通過催化氧化FEs形成聚合產(chǎn)物，如過氧化物酶（Peroxidases，PODs，EC 1.11.1.X）和漆酶（Laccase，Lac，EC 1.10.3.2）［18-21］；（2）水解酶類（Hydrolases），通過解離結(jié)合基團(tuán)將CEs水解為相對(duì)應(yīng)的FEs，如芳基硫酸酯酶（Arylsulfatase，ArySTS，EC 3.1.6.1）和β-葡糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUSB，EC 3.2.1.31）［22-25］。典型 SEs降解、轉(zhuǎn)化酶的物理化學(xué)性質(zhì)及三維結(jié)構(gòu)，見表1和圖2。除以上幾種酶外，還有一些細(xì)菌產(chǎn)生的酶對(duì)SEs具有降解、轉(zhuǎn)化作用，如亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonassp.）可產(chǎn)生單加氧酶（Monooxygenase）、諾卡氏菌屬（Nocardiasp.）及不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）可產(chǎn)生雙加氧酶（Dioxygenase）、紅球菌屬（Rhodococcussp.）及鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonassp.）可產(chǎn)生單加氧酶、雙加氧酶、羥基類固醇脫氫酶（Hydroxysteroid dehydrogenase，HSD）等［26-27］。

圖1 天然SEs結(jié)構(gòu)示意圖

2 氧化還原酶對(duì)FEs的降解轉(zhuǎn)化作用

FEs主要包括雌酮（Estrone，E1）、17α-雌二醇（17α-Estradiol，17α-E2）、17β-雌二醇（17β-Estradiol，17β-E2）、雌三醇（Estriol，E3）。氧化還原酶去除FEs的主要作用機(jī)制為氧化耦合反應(yīng)，催化FEs A環(huán)酚羥基形成高氧化潛能、高活性的C2、C4位自由基與C3位苯氧自由基等自由基中間體（圖3），通過C-O-C、C-C共價(jià)鍵自耦合、相互耦合形成二聚體，同時(shí)受到溶劑類型、pH、A環(huán)取代位置等影響［14，18，21，31-32］。FEs A 環(huán) C3 位氧原子的電荷密度較高而自旋密度較低，因此與C-O-C鍵相比，在動(dòng)力學(xué)上更有利于形成C-C鍵聚合產(chǎn)物［33］。二聚體可繼續(xù)形成自由基，作為酶的底物繼續(xù)氧化耦合生成三聚體、低聚體，甚至高聚體，但聚合物的溶解度隨相對(duì)分子質(zhì)量增加急劇降低，難以進(jìn)一步耦合形成高分子量的聚合物［32，34］。氧化還原酶催化FEs生成的聚合產(chǎn)物溶解度較低，在污水處理過程中易于通過吸附、過濾、沉淀等作用被去除。氧化還原酶的催化能力通常與氧化還原電位（表1）和糖基化程度相關(guān)，高氧化還原電位有利于酶對(duì)SEs的催化氧化，在一定范圍內(nèi)，酶的穩(wěn)定性隨糖基化程度的增加而提高，其中LiP的糖基化程度較高，為20%-30%，高于HRP（18%-22%）、Lac（10%-20%）和MnP（5%-15%）［35-36］。PODs和 Lac催化機(jī)理的主要區(qū)別在于電子受體，通常PODs以H2O2作為電子受體催化其活性，同時(shí)還需要輔酶因子的參與，而Lac以空氣或水中的氧分子作為電子受體，不需額外添加氧化劑［17，34，37-39］。FEs在 Lac 催化體系中的去除速率低于PODs，但PODs不穩(wěn)定，在復(fù)雜基質(zhì)及過量H2O2條件下易于失活，而Lac的穩(wěn)定性更強(qiáng)［34］。另外，與A環(huán)C3位相結(jié)合的CEs（如E1-3S、17β-E2-3S、E1-3G、17β-E2-3G）受到硫酸鹽或葡糖苷酸鹽基團(tuán)的保護(hù)，不易被氧化還原酶催化氧化形成自由基［22］。不同基質(zhì)中氧化還原酶對(duì)FEs的去除效率如表2所示。

表1 典型SEs降解、轉(zhuǎn)化酶的主要物理化學(xué)性質(zhì)［28］

圖2 典型SEs降解、轉(zhuǎn)化酶三維結(jié)構(gòu)示意圖［30］

2.1 過氧化物酶的降解作用

PODs在自然界中分布廣泛，可由動(dòng)植物、真菌、細(xì)菌產(chǎn)生，根據(jù)是否含血紅素分為血紅素（Heme-peroxidases）及非血紅素過氧化物酶（Nonheme peroxidases）［51-52］。在 FEs的 催 化氧化中應(yīng)用較多的PODs主要為血紅素過氧化物酶，包括兩大類：（1）真菌分泌的胞外木質(zhì)素降解酶（Lignin modifying enzymes，LMEs），如 LiP、MnP、VP。（2）植物產(chǎn)生的HRP［51］。PODs的催化機(jī)理為：血紅素蛋白被H2O2或小分子過氧化物氧化為化合物I（卟啉π陽離子自由基氧鐵基團(tuán)，F(xiàn)eIV=O·+），隨后化合物I從底物得到一個(gè)電子還原為化合物Ⅱ（氧鐵基團(tuán)，F(xiàn)eIV=O），再氧化底物得到一個(gè)電子將酶還原為基態(tài)FeIII，其中最后一步為限速步驟［13，53］，F(xiàn)Es被催化氧化生成自由基后通過耦合反應(yīng)生成聚合產(chǎn)物。

表2 氧化還原酶對(duì)不同基質(zhì)中FEs的去除

2.1.1 木質(zhì)素降解酶 LiP在酸性條件下催化去除FEs效果較好，Wang等［41］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在pH3，0.2 mol/L H2O2條件下，120 U/L LiP對(duì)2.7 mg/L E1和17β-E2的去除率為60%-90%。Mao等［19］實(shí)驗(yàn)表明在 pH4.6，0.05 mmol/L H2O2條件下，2.5 mg/L 17β-E2可被20 U/L LiP完全去除，主要產(chǎn)物為17β-E2低聚物，少量轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物E1。藜蘆醇作為白腐真菌（White-rot fungi，WRF）的次生代謝產(chǎn)物以及與LiP共生的活性底物，具有較強(qiáng)的氧化能力，在LiP催化FEs過程中可被氧化成陽離子自由基，保護(hù)LiP避免失活并增強(qiáng)其活性，且對(duì)失活的LiP有一定的恢復(fù)作用［19，32，40］。無藜蘆醇時(shí)，初始濃度為5 mg/L的17β-E2反應(yīng)60 min后去除率僅為40%，而添加藜蘆醇能夠提高LiP對(duì)FEs的催化去除效率，反應(yīng) 20 min 便能將 5 mg/L 17β-E2 完全去除［19］。

MnP是一類以多種形式存在的糖基化血紅素過氧化物酶，其結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)與其他PODs有所不同，通過將Mn2+氧化為Mn3+完成催化氧化［54］。Tamagawa等［44］試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)600 U/L MnP處理1 h后，0.01 mmol/L E1被完全去除，2 h后雌激素活性得以完全去除。

VP是一種混合酶，結(jié)合了LiP和MnP兩種酶的底物特異性，在H2O2、Mn2+以及底物的共同作用下，將Mn2+氧化為Mn3+，催化氧化FEs形成聚合產(chǎn)物［21］。Eibes等［42］考察了 VP 對(duì) E1 和 17β-E2 的去除，結(jié)果表明在低酶活性（10 U/L）條件下，反應(yīng)25 min內(nèi)兩種化合物能夠被完全去除。Taboada-Puig等［21，43］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在最優(yōu)條件下，VP可去除污水中高濃度（1.3-8.8 mg/L）及環(huán)境濃度（1.2-6.1 μg/L）的E1和17β-E2，并形成二聚體、三聚體和羥基雌酮（Hydroxyestrone，OH-E1）等產(chǎn)物。

2.1.2 辣根過氧化物酶 HRP是一種含鐵卟啉輔基的PODs，含有兩個(gè)不同的金屬中心：血紅素和兩個(gè)鈣原子，主要由植物分泌，在辣根（Horseradish）中含量最高，并因此而得名［35，55］。Auriol等［18，56］研究發(fā)現(xiàn)在pH為7，溫度為25℃條件下，被H2O2激活后，32 U/L HRP在1 h內(nèi)可去除人工污水中97%的100 ng/L E1、17β-E2或E3，反應(yīng)5 h后去除率為99%；但在實(shí)際污水中，去除相同濃度的FEs需添加8 000-10 000 U/L HRP，說明復(fù)雜污水基質(zhì)成分使得HRP氧化能力受到抑制，從而顯著影響了FEs的氧化去除。

值得注意的是，H2O2作為PODs的電子受體，同時(shí)又是這幾種酶的抑制劑，過量H2O2會(huì)使反應(yīng)過程中過渡態(tài)化合物形成無反應(yīng)活性的化合物III（鐵超氧化物，F(xiàn)eIII=O2·-），稱之為“自殺性失活”（Suicide inactivation）［13，57］。而作為一種混合酶，VP 的“自殺性失活”更加復(fù)雜，由于其存在3個(gè)氧化位點(diǎn)及多個(gè)催化產(chǎn)物，對(duì)H2O2濃度最敏感［57］。有研究表明，添加穩(wěn)定劑可保護(hù)酶活性避免失活，如聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）、聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）、聚乙烯（Polythene，PE）、明膠（Gelatin）、多糖（Polysaccharide）等［13，36］。

2.2 漆酶的催化氧化作用

Lac是一類多酚氧化酶，自然界中Lac可由高等植物、昆蟲、細(xì)菌、真菌產(chǎn)生，其中真菌漆酶（Fungal Laccase）的底物特異性低，氧化能力強(qiáng)，應(yīng)用最為廣泛［14，37，51-52］。Lac 催化活性中心通常含有 4 個(gè)銅離子，三環(huán)的銅簇位點(diǎn)以空氣或水中的氧分子作為電子受體，形成自由基后，T1銅中心參與FEs單電子氧化，將O2還原為水，生成C-O-C、C-C聚合產(chǎn)物［11，55，58］。FEs在 A 環(huán) C3 位含有酚羥基，能夠被Lac催化產(chǎn)生苯氧自由基，通過氧化耦合反應(yīng)形成二聚體、三聚體，有研究表明Lac還可將17β-E2氧化為 E1［20，39，50，59］，而與之相反，Singh 等［48］在反應(yīng)產(chǎn)物中未檢測(cè)出E1和E3。

Lloret等［39］研究發(fā)現(xiàn)，在水相反應(yīng)體系中，pH4時(shí)Lac的酶活性最高，但穩(wěn)定性較低，而其酶活性在pH7時(shí)較低，但穩(wěn)定性高，同時(shí)可觀察到反應(yīng)初期Lac在pH4時(shí)有顯著失活，而在pH7條件下，6 h內(nèi)酶活性較穩(wěn)定。Singh等［55］實(shí)驗(yàn)研究表明，在2 500 U/L Lac條件下，在水相體系中反應(yīng)5 h后0.2 mg/L 17β-E2去除率為93%，而在土壤中去除率為87.1%。土壤含水率對(duì)Lac處理效果也有影響，經(jīng)24 h 10 U/g Lac處理后，非飽和土壤中0.2 mg/g 17β-E2去除率僅為32.1%，而在飽和土壤中去除率達(dá)到62.6%，這可能由于Lac酶分子在水相中有利于與17β-E2接觸，從而去除效果增強(qiáng)［48］。在pH為7，溫度為25℃條件下，20 000 U/L Lac在1 h內(nèi)可完全去除人工及實(shí)際污水中100 ng/L E1、17β-E2或E3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其催化FEs耦合反應(yīng)受污水基質(zhì)成分的影響較?。?6］。有研究表明在相同濃度下，Lac催化氧化E1的反應(yīng)速率僅為17β-E2的60%，其區(qū)別在于二者在C17位與Lac的親和性［22］。Lac的穩(wěn)定性在水相和土壤體系中有較大差異，雖然在水相（0.46 h-1）中其失活速率比在土壤（0.003 1 h-1）中快很多，但水相中Lac對(duì)17β-E2的去除速率比在土壤中高100多倍［48］，Lac在土壤中的活性持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)彌補(bǔ)了其反應(yīng)速率慢的缺點(diǎn)。

漆酶介導(dǎo)反應(yīng)體系（Laccase mediator system，LMS）指Lac在介體和氧分子存在時(shí)進(jìn)行催化氧化的反應(yīng)體系，介體的氧化還原電位較高，可分為天然及人工合成介體，如紫脲酸（Violuric acid，VA）、丁香醛（Syringaldehyde，SA）、1-羥基苯并三氮唑（1-hydroxy-benzotriazole，HBT）、2，2-聯(lián)氮 -二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfnoic acid），ABTS）等［45-46，60-62］。介體在酶和目標(biāo)化合物間起到“電子穿梭”的作用，作用機(jī)制主要包括氫自由基轉(zhuǎn)移、電子轉(zhuǎn)移以及離子氧化，添加介體可提高FEs的氧化程度，從而增強(qiáng) Lac 催化去除 FEs反應(yīng)［17，61，63］。Auriol等［46］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)Lac酶活性低于20 000 U/L時(shí)添加HBT可提高17β-E2的去除效率，而當(dāng)酶活性高于20 000 U/L時(shí)，兩種條件下17β-E2的去除率沒有明顯差異。Sei等［64］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在無介體條件下，300 U/L Lac反應(yīng)6-12 h后可完全去除20 mg/L 17β-E2和E3，24 h后E1的去除率為90%，添加介體ABTS或HBT后E1僅在3 h內(nèi)可被Lac完全去除。Lloret等［62］實(shí)驗(yàn)表明，不添加介體條件下，經(jīng)Lac處理24 h后17β-E2得以完全去除，而E1不易去除，在Lac-VA、Lac-HBT和Lac-SA體系中E1的去除率分別為100%、88%和74%。在以后的研究中，應(yīng)探索成本低、性質(zhì)穩(wěn)定、毒性低及水溶性好的介體。

2.3 有機(jī)質(zhì)對(duì)氧化還原酶催化FEs的影響

土壤與水體環(huán)境中富含有機(jī)質(zhì)，有研究表明高濃度有機(jī)質(zhì)可顯著降低FEs的酶催化去除速率，這是由于有機(jī)質(zhì)含有大量酚類官能團(tuán)，形成自由基后可與FEs及其自由基相互耦合，形成交叉耦合化合物，從而抑制FEs自耦合產(chǎn)物的形成［33-34，65-66］。Mao等［32］試驗(yàn)證實(shí)，藜蘆醇對(duì)LiP催化能力的增強(qiáng)會(huì)受到有機(jī)質(zhì)的抑制。當(dāng)有機(jī)質(zhì)和藜蘆醇同時(shí)存在時(shí)，二者在LiP表面活性位點(diǎn)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致17β-E2的去除率有所降低，這是由于有機(jī)質(zhì)和17β-E2的交叉耦合反應(yīng)抑制了藜蘆醇對(duì)LiP去除17β-E2的增強(qiáng)作用［23，40］。Huang 等［65］研究了有機(jī)質(zhì)對(duì) HRP去除17β-E2的影響，發(fā)現(xiàn)有機(jī)質(zhì)不僅抑制17β-E2的去除，還會(huì)影響17β-E2氧化自耦合產(chǎn)物二聚體、三聚體的形成。Sun等［66］研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)質(zhì)可與Lac表面活性位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)或與17β-E2結(jié)合，從而抑制17β-E2的酶催化氧化去除，且其抑制率隨有機(jī)質(zhì)濃度增加而升高，有機(jī)質(zhì)濃度為50 mg/L時(shí)，Lac對(duì)17β-E2的去除率不足5%。夏青［55］通過試驗(yàn)研究表明，有機(jī)質(zhì)對(duì)HRP去除E1、17β-E2的抑制作用并不明顯，去除率仍高于80%，而在Lac催化體系中，有機(jī)質(zhì)對(duì)E1、17β-E2的去除有抑制作用，說明有機(jī)質(zhì)對(duì)HRP活性的影響較小。

3 水解酶對(duì)CEs的降解轉(zhuǎn)化作用

FEs羥基可與硫酸鹽或葡糖苷酸鹽通過酯化作用形成CEs，其中單羥基化合物E1的結(jié)合態(tài)為單一形式，多羥基化合物E2、E3則可與一個(gè)或多個(gè)結(jié)合基團(tuán)形成硫酸鹽（CSEs）、葡糖苷酸鹽（CGEs）、硫酸鹽-葡糖苷酸鹽（CS-GEs）形式的CEs。與FEs相比，CEs的水溶性、遷移性高，而吸附性較低。研究普遍認(rèn)為CEs無生物毒性，但其解離后又重新生成雌情活性高的FEs，潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)不應(yīng)被忽視。CEs結(jié)合基團(tuán)的解離主要為ArySTS和GUSB的作用，其活性與溫度及微生物豐度密切相關(guān)，酶催化條件下CEs的解離在熱力學(xué)上不可逆［16］。CGEs可被GUSB解離為相對(duì)應(yīng)的FEs，ArySTS通過水解硫酯鍵將CSEs酶解為其對(duì)應(yīng)的FEs［25，67］。研究表明，GUSB和ArySTS活性與有機(jī)質(zhì)含量、土壤黏粒顯著相關(guān)［23，68-69］。目前有關(guān)CEs酶降解、轉(zhuǎn)化的研究多集中在E1及E2的結(jié)合態(tài)，而有關(guān)E3結(jié)合態(tài)形式酶解的研究相對(duì)較少。

3.1 芳基硫酸酯酶的水解作用

ArySTS可由微生物、動(dòng)植物分泌，在污水及活性污泥中活性和含量水平較高［70-71］。土壤中ArySTS主要以吸附態(tài)存在于腐殖質(zhì)、黏土礦物，穩(wěn)定性增加且不易失活，而很少以游離態(tài)形式存在［68］，Bai等［72］研究也表明ArySTS僅在土壤吸附相中保持活性，而在水相中幾乎沒有活性。水體中ArySTS主要來自底泥微生物的分泌，也可通過徑流、合流制污水管網(wǎng)溢流等方式攜帶產(chǎn)生ArySTS的微生物進(jìn)入水體［25，70］。然而，由于環(huán)境中ArySTS活性與豐富度水平相對(duì)較低，CSEs硫酯鍵的解離作用通常較弱［73］。Liu等［74］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在1 mL pH5的緩沖液，55℃條件下，添加50 μL ArySTS反應(yīng)3 h后，E1-3S和E3-3S的解離效率超過75%，而17β-E2-3S的解離效率低于60%。Bai等［72，75］實(shí)驗(yàn)表明，ArySTS對(duì)17β-E2-17S的解離作用僅為A環(huán)羥基化作用的1/10，主要產(chǎn)物為 OH-17β-E2-17S 和 diOH-17β-E2-17S。Ma和Yates［76-77］也發(fā)現(xiàn)農(nóng)田土壤、河水及沉積物中17β-E2-3S主要通過C17位羥基的氧化生成初級(jí)代謝產(chǎn)物E1-3S，而酶的解離作用次之。另外，氧化還原條件也會(huì)影響ArySTS的活性，Zheng等［78］測(cè)定了奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)污水17α-E2-3S的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，結(jié)果表明，在有氧條件下主要通過D環(huán)C17位的羥基氧化為酮基，從而生成E1-3S，而在厭氧條件下A環(huán)C3位硫酯鍵的酶解占據(jù)主導(dǎo)代謝地位。

值得注意的是，芳基磺基轉(zhuǎn)移酶（Arylsulfotransferase，ArySULT，EC 2.8.2.1）與ArySTS的作用則相反， 能 夠 將 FEs重 新 轉(zhuǎn) 化 為 CSEs［67］。Goeppert等［67，79］研究了土壤中17β-E2的轉(zhuǎn)化路徑，結(jié)果表明17β-E2可先降解為E1，隨后在ArySULT的作用下轉(zhuǎn)化為E1-3S。

3.2 β-葡糖苷酸酶的水解作用

GUSB屬糖苷類水解酶，細(xì)菌、真菌及高等動(dòng)植物均可產(chǎn)生，廣泛存在于污水、活性污泥、土壤、沉積物中［23］。在河水及沉積物中，Ma和Yates［76-77］觀察到17β-E2-3G主要通過C3位結(jié)合基團(tuán)的解離生成17β-E2，而在農(nóng)田土壤中主要為C17位羥基氧化作用生成E1-3G，這可能由于土壤中GUSB含量水平不足所致。Kumar等［80］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在河水中反應(yīng)5 d后，E1-3G完全解離為E1，而僅有64%的17β-E2-3G解離為17β-E2及隨后的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物E1，這可能由于GUSB對(duì)兩種CGEs的解離存在差異。

糞大腸菌群，例如埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）可合成GUSB和ArySTS，從蝸牛（Helix pomatia，H. pomatia）中提取的GUSB-ArySTS混合酶也廣泛應(yīng)用于 CEs的酶解及檢測(cè)［71，74］。E. coli合成的ArySTS較少且活性、親和性相對(duì)較弱，H.pomatia中提取的GUSB-ArySTS混合酶中ArySTS活性也相對(duì)較低［23，81］，因此與 CGEs相比，CSEs在環(huán)境中的穩(wěn)定性和持久性更強(qiáng)［80，82］。Ben 等［82］實(shí)驗(yàn)表明，10 μmol/U酶抑制劑STX 64和D-葡糖二酸-1，4-內(nèi)酯可分別有效抑制污水中ArySTS和GUSB活性，從而阻礙CEs的解離。結(jié)合基團(tuán)（硫酸鹽或葡糖苷酸鹽）及位置（A和/或D環(huán)）的差異會(huì)影響CEs的酶降解、轉(zhuǎn)化過程。D’Ascenzo等［83］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A環(huán)（E1-3G、17β-E2-3G、E3-3G）CGEs比D環(huán)（17β-E2-17G、E3-16G）CGEs易于解離，不過一旦反應(yīng)啟動(dòng)，一天內(nèi)均可完全解離為相對(duì)應(yīng)的FEs；而對(duì)于CSEs，E1-3S、17β-E2-3S和E3-3S完全解離需6-8 d，說明污水中ArySTS活性相比于GUSB弱得多。Liu等［16］比較了5種CEs的解離速率，并劃分為低（E1-3S）、中等（E1-3G、17β-E2-3S和E3-3G）和高（E3-16G）解離速率。Gomes等［84］通過活性污泥批試驗(yàn)表明，CEs（E1-3S、E1-3G和E3-16G）在微生物分泌的酶作用下可解離為FEs，而滅菌條件下未檢測(cè)到FEs，解離優(yōu)先順序?yàn)镋1-3G＞E3-16G＞E1-3S，其影響因素為：結(jié)合基團(tuán)＞基團(tuán)位置＞SEs類型。

水解酶通過解離硫酸鹽或葡糖苷酸鹽結(jié)合基團(tuán)將CEs水解為相對(duì)應(yīng)的FEs，氧化還原酶可催化FEs形成C2、C4位自由基及C3位苯氧自由基中間體，通過C-O-C、C-C共價(jià)鍵自耦合、交叉耦合形成二聚體、三聚體，甚至高聚體。環(huán)境中自由及結(jié)合態(tài)SEs的酶降解、轉(zhuǎn)化路徑如圖3所示。

4 展望

酶對(duì)環(huán)境中自由及結(jié)合態(tài)SEs的去除的應(yīng)用受到諸多因素限制，對(duì)今后酶在SEs降解轉(zhuǎn)化的規(guī)?；瘧?yīng)用、機(jī)理研究、聯(lián)合應(yīng)用、固定化酶、酶工程等方面進(jìn)行了展望。

酶催化去除SEs的研究大多處于小試、中試試驗(yàn)階段，在污水、污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用相對(duì)較少［31，43，47，49，52］，由于理論研究與實(shí)際應(yīng)用存在差異，評(píng)估酶在實(shí)際應(yīng)用中的可行性十分重要。污水中各種干擾因素會(huì)對(duì)酶的催化氧化效果產(chǎn)生影響，如pH、溫度、鹽度、溶解氧、重金屬、抑制物質(zhì)等［36］。應(yīng)進(jìn)一步研究酶處理含SEs污水的工作機(jī)理和環(huán)境因素的影響，將理論應(yīng)用于實(shí)際工業(yè)化處理中。酶膜反應(yīng)器（Enzymatic membrane reactor，EMR）可應(yīng)用于污水中有機(jī)污染物連續(xù)處理［14，38，85］，目前已有研究在小試階段應(yīng)用EMR處理FEs，去除效率可達(dá)到 80%-100%［20，43，60］，常用的膜材料有醋酸纖維素（Cellulose acetate，CA）、硝酸纖維素（Nitrocellulose，NC）、聚四氟乙烯（Polytetrafluoroethylene，PTFE）、聚丙烯腈（Polyacrylonitrile，PAN）、聚醚砜（Polyethersulfone，PES）、聚酰胺（Polyamide，PA）等［85］。在規(guī)?；瘧?yīng)用時(shí)，需要解決酶失活以及膜的持續(xù)性能問題，同時(shí)，EMR在SEs特別是CEs去除方面的應(yīng)用仍需進(jìn)一步開發(fā)和研究。酶催化應(yīng)用于SEs污染土壤修復(fù)不會(huì)產(chǎn)生二次污染，然而不同土壤類型、氣候條件、微生物群落等均會(huì)對(duì)酶修復(fù)SEs污染土壤產(chǎn)生影響，實(shí)現(xiàn)場(chǎng)地修復(fù)仍需要長(zhǎng)期系統(tǒng)地研究。

在酶處理SEs過程中伴隨著中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，且有些產(chǎn)物仍具有雌情活性，而大多數(shù)研究沒有檢測(cè)反應(yīng)后總雌情活性，以及對(duì)降解、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。隨著高分辨質(zhì)譜（HRMS）、核磁共振（NMR）等分析檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展［58，86］，應(yīng)在反應(yīng)中間產(chǎn)物的鑒定，自由基的生成，C-O-C、C-C鍵聚合產(chǎn)物優(yōu)先順序及比例等方面展開研究，進(jìn)一步闡明SEs的酶催化反應(yīng)機(jī)理，比較不同類型的酶對(duì)SEs的去除效率，深入分析SEs的降解、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及路徑。

WRF（如Trametes versicolor、Phanerochaete chrysosporium）可分泌Lac、LiP、MnP，且不同種類的菌分泌的酶類型存在差異，利用WRF分泌的胞外酶體系催化氧化FEs，可作為規(guī)模化應(yīng)用發(fā)展的方向［51，59］。通常污水、污泥、土壤中存在著多種類型的自由態(tài)和結(jié)合態(tài)SEs，是十分復(fù)雜的混合體系，而單一種類的酶很難同時(shí)去除不同形態(tài)的SEs。在GUSB-Lac聯(lián)用酶體系處理污水中不同形態(tài)SEs（E1、17β-E2、17β-E2-3G）的試驗(yàn)中，Tanaka等［22］發(fā)現(xiàn)幾種化合物均能夠得到有效去除。水解酶與氧化還原酶聯(lián)用同時(shí)處理復(fù)雜基質(zhì)中的FEs和CEs（CSEs和CGEs），或產(chǎn)生這些酶的微生物的聯(lián)合使用（如WRF和E. coli）可作為今后研究的重要課題。

溶解態(tài)的游離酶在污水中存在易變性失活、易流失、難以回收等問題，從而導(dǎo)致處理成本過高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。酶固定化技術(shù)可以提高酶的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用，并在SEs的去除中得以應(yīng)用［54，87-89］，主要分為物理法（如吸附）和化學(xué)法（如包埋、微膠囊、交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合），且各有優(yōu)缺點(diǎn)，載體材料及固定化技術(shù)的選擇取決于酶的類型和催化過程［54，90］。探尋經(jīng)濟(jì)、高效、生物相容且環(huán)境友好的固定化材料，降低酶活性損失并提高穩(wěn)定性是未來發(fā)展的方向。

自然條件下微生物產(chǎn)生酶的量非常少，提高酶產(chǎn)量和催化效率，降低應(yīng)用成本等是需要解決的主要難題，可通過酶工程（如納米酶、修飾酶和超酶）、基因編輯、DNA重組等技術(shù)提高酶產(chǎn)量、穩(wěn)定性及活性、催化效率及降低酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)［51-52，91］。