李江 耿立召 許建平

（先正達(dá)生物科技（中國）有限公司，北京 102206）

基因編輯是目前生命科學(xué)研究的一個熱點(diǎn)，CRISPR/Cas9（The clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated 9）是基因編輯技術(shù)中的一個重要工具。目前廣泛使用的CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌的對抗外源DNA入侵的一種防御系統(tǒng)，可將入侵的噬菌體基因組DNA等外源核酸序列切除［1］。自2013年首次報道CRISPR/Cas9在生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因編輯以來［2-3］，由于其操作簡單，效率高，所以該系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于動植物，成為藥物開發(fā)、疾病治療和農(nóng)作物品質(zhì)改良等領(lǐng)域的一個重要基因編輯工具，具有廣泛應(yīng)用前景［4］。

基因編輯中所用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬細(xì)菌II型的CRISPR/Cas9，由Cas9蛋白和引導(dǎo)RNA（Guide RNA，gRNA）兩種分子組成，其中Cas9蛋白是一種依賴于引導(dǎo)RNA分子的核酸切割酶，只有裝載引導(dǎo)RNA后才能激活自身識別和切割基因組DNA的功能。而引導(dǎo)RNA除激活Cas9活性外，還含有一段與靶基因組DNA反向互補(bǔ)的20 個核苷酸序列，將Cas9蛋白/引導(dǎo)RNA復(fù)合體定靶向位于目的DNA序列［1］。目前關(guān)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究綜述多集中于工作機(jī)理、Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)與工作模式，以及CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用發(fā)展，而對CRISPR/Cas9中的引導(dǎo)RNA研究進(jìn)展還缺乏系統(tǒng)性回顧。因此，本文將從引導(dǎo)RNA的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生方式以及對基因編輯頻率的影響這幾個方面，對CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的引導(dǎo)RNA研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 引導(dǎo)RNA的序列與結(jié)構(gòu)

在細(xì)菌中，CRISPR/Cas9的引導(dǎo)RNA由兩條RNA分子組成，CRISPR RNA（CrRNA）和trans activating CRISPR RNA（TracrRNA）（ 圖 1-a）。crRNA的5′端包含20個堿基與噬菌體基因組DNA互補(bǔ)，并由重復(fù)間隔序列串聯(lián)構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄成一條長的RNA分 子（Precursor crRNAs，pre-crRNAs） 后， 經(jīng) 過RNA 酶III加工過程產(chǎn)生一系列短的40 nt左右的包含間隔序列的成熟crRNA。tracrRNA 具有與crRNA互補(bǔ)的一段序列，crRNA與tracrRNA結(jié)合形成部分雙鏈互補(bǔ)的兩個RNA分子復(fù)合體［1］。Cas9蛋白首次在體外證明具有切割功能時發(fā)現(xiàn)其切割活性是由兩條引導(dǎo)RNA分子參與產(chǎn)生的，只加入CrRNA不 能使Cas9蛋白實(shí)現(xiàn)對質(zhì)粒DNA的切割，只有再加入TracrRNA時才能使Cas9體外切割質(zhì)粒DNA，獲得與CRISPR/Cas9體內(nèi)相同的生物學(xué)活性［5］。CrRNA 與TracrRNA 有兩個RNA分子組成，crRNA 5′端20個堿基與靶基因互補(bǔ)，與crRNA配對結(jié)合后促進(jìn)CrRNA的成熟。雖然CrRNA與TracrRNA通過互補(bǔ)序列形成的雙鏈分子與Cas9結(jié)合后產(chǎn)生的基因編輯在原核生物中應(yīng)用較好，但在真核生物中因技術(shù)復(fù)雜難以進(jìn)行應(yīng)用。為了便于操作，科學(xué)家將CrRNA的3′端與TracrRNA的5′端通過GAAA的核苷酸序列相連，并縮短了雙鏈互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域僅保留4個核苷酸對，形成48 nt的單引導(dǎo)RNA分子（圖1-b），并通過延長3′端37個堿基后（圖1-c），獲得編輯效率很高的單引導(dǎo)RNA分子結(jié)構(gòu)。目前，85nt的單引導(dǎo)RNA序列結(jié)構(gòu)是CRISPR/Cas9在基因編輯中廣泛使用的一個分子結(jié)構(gòu)［2-3，5-8］。

圖1 引導(dǎo)RNA的序列結(jié)構(gòu)變化［9］

目前關(guān)于引導(dǎo)RNA的結(jié)構(gòu)研究以是以單引導(dǎo)RNA序列為模型獲得。引導(dǎo)RNA的序列可分為兩部分，5′端1-20個堿基是與目標(biāo)DNA互補(bǔ)的Protospacer序 列， 它 與 PAM（Protospacer adjacent motif）序列共同決定Cas9蛋白目的DNA序列上的定位，在PAM上有的3-4位核苷酸之間產(chǎn)生雙鏈斷裂。Protospacer之后的核苷酸為引導(dǎo)RNA的折疊結(jié)構(gòu)（Scaffold fold），含有多個RNA二級結(jié)構(gòu)。在這些RNA二級結(jié)構(gòu)中，雙鏈互補(bǔ)區(qū)域的14個堿基由CrRNA與TracrRNA的重復(fù)序列反向互補(bǔ)形成，其中G27、G28、A41、A42、G43和U44不配對而產(chǎn)生一個突起（Bulge），突起上游的雙鏈序列稱為下位莖（Lower stem），下游的雙鏈序列成為上位莖（Upper stem）。上位莖下游含有3個莖環(huán)組成的結(jié)構(gòu)，依次為 Nexus，Hairpin1 和 Hairpin2［10-11］。對引導(dǎo)RNA的二級結(jié)構(gòu)在不同文章中的命名不完全相同，但對應(yīng)的結(jié)構(gòu)是一致的。通過對Cas9蛋白結(jié)合引導(dǎo)RNA和目標(biāo)DNA序列的形成的晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，引導(dǎo)的5′端序列與目標(biāo)DNA序列形成的復(fù)合體被Cas9蛋白包裹于充滿負(fù)電荷的多肽內(nèi)部，引導(dǎo)RNA的第10-20個核苷酸稱為種子序列（Seed region），與模板DNA互補(bǔ)形成有序而牢固的雙鏈結(jié)構(gòu)，當(dāng)種子序列存在2個及以上堿基的與目的DNA序列產(chǎn)生錯配時，Cas9蛋白不能與目的DNA序列牢固結(jié)合無法對DNA序列產(chǎn)生切割［12］。引導(dǎo)RNA中的反向互補(bǔ)的雙鏈重復(fù)序列結(jié)構(gòu)被Cas9蛋白的識別結(jié)構(gòu)域（Recognition，REC）和核酸酶結(jié)構(gòu)域（Nuclease，NUC）以序列依賴的方式識別。此結(jié)構(gòu)中的非互補(bǔ)突起部分及相鄰的核苷酸是Cas9蛋白識別的核心序列，而末尾的C30∶G39和A32∶U37不被Cas9蛋白識別而突出于Cas9蛋白表面，提示此部分雙鏈互補(bǔ)序列是經(jīng)RNA酶III加工產(chǎn)生的。引導(dǎo)RNA雙鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)下游的三個莖環(huán)結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定Cas9蛋白與引導(dǎo)RNA復(fù)合體的重要序列。其中Nexus的序列中有部分核苷酸（52、53和59-61）是被Cas9蛋白的REC結(jié)構(gòu)域和NUC結(jié)構(gòu)域中的1103-1107 位的氨基酸結(jié)合，被PAM激活結(jié)構(gòu)域（PAM-interacting，PI）所識別，與雙鏈重復(fù)互補(bǔ)序列中的突起結(jié)構(gòu)共同參與激活Cas9蛋白對PAM序列的識別，引導(dǎo)RNA打開Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)去識別PAM序列［13］。其余兩個莖環(huán)結(jié)構(gòu)Hairpin1和Hairpin2的大部分序列暴露于Cas9蛋白表面，只有Hairpin1中的63-65、67和Hairpin2中的92位核苷酸被Cas9蛋白的NUC結(jié)構(gòu)域識別［10］，這兩個莖環(huán)可以提高Cas9蛋白與引導(dǎo)RNA復(fù)合體的穩(wěn)定性，并且這段區(qū)域中的核苷酸能容忍較大范圍的改變，是改造引導(dǎo)RNA的一個可行區(qū)域［11-12，14］?？梢?，引導(dǎo)RNA的雙鏈復(fù)合體和Nexus是Cas9蛋白行使功能所必需的結(jié)構(gòu)，而Hairpin1和Hairpin2以及之間的5個連接堿基可幫助穩(wěn)定Cas9蛋白與引導(dǎo)RNA及目標(biāo)DAN形成的復(fù)合體，突變將影響Cas9蛋白的切割效率。

引導(dǎo)RNA的序列特征在Type II的 CRISPR-Cas9系統(tǒng)中具有保守性。在Streptococcus和Lactobacillus中分離到的41 種Cas9基因中，盡管Cas9的蛋白序列根據(jù)一致性可分為3組，但引導(dǎo)RNA中CrRNA與TracrRNA反向重復(fù)序列結(jié)合的雙鏈序列高度保守，都存在不配對的核苷酸突起結(jié)構(gòu)以及相鄰的上下位莖序列，是II型CRISPR/Cas9特有的結(jié)構(gòu)。但核苷酸組成和上下位莖的長度在不同來源的Cas9中差異很大，其中較短的下位雙鏈序列長度保守，較長的上位雙鏈序列長度在不同種類的菌中變異較大。但最為保守的部分為TracrRNA的第一個莖環(huán)，甚至在不同菌中都含有高度一致的堿基，如A52和C55與Cas9蛋白的1 103-1 107 位的氨基酸結(jié)合［10］。對S. thermophiles中的兩個同源Cas9蛋白Sth1Cas9和Sth3Cas9以及對應(yīng)的引導(dǎo)RNA序列CRISPR1 sgRNA和CRISPR3 sgRNA進(jìn)行置換，未能檢測到Sth1Cas9和Sth3Cas9的切割活性。然而當(dāng)CRISPR1 sgRNA含有 CRISPR3 的Protospacer 序列后可以使Sth3 Cas9產(chǎn)生切割活性。進(jìn)一步對兩種引導(dǎo)RNA的莖環(huán)同時進(jìn)行互換后發(fā)現(xiàn)，人工產(chǎn)生的引導(dǎo)RNA不能使原對應(yīng)的Cas9蛋白產(chǎn)生切割活性，但使異源的Cas9產(chǎn)生了切割活性。而只互換其中的一個莖環(huán)不足以產(chǎn)生這種效果［10］。說明引導(dǎo)RNA的序列結(jié)構(gòu)在不同類型的CRISPR/Cas9中具有獨(dú)特性，表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)化具有不同的分支；也表明引導(dǎo)RNA對CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)揮功能具有非常重要的決定作用。

2 引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生方式

引導(dǎo)RNA在細(xì)菌和古細(xì)菌中由體內(nèi)的RNA 轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)產(chǎn)生，但在CRISPR/Cas9應(yīng)用于基因編輯技術(shù)時，需要在體內(nèi)表達(dá)人工設(shè)計的引導(dǎo)RNA，引導(dǎo)RNA的5′端1-20個核苷酸對應(yīng)目的DNA序列不同而做改變，使Cas9蛋白在特定預(yù)期位點(diǎn)產(chǎn)生切割。引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中的重要過程，引導(dǎo)RNA需要滿足以下要求：（1）引導(dǎo)RNA保持在細(xì)胞核內(nèi)。（2）產(chǎn)生的引導(dǎo)RNA的5′端不能有與目的序列不配對的多個額外核苷酸。針對不同的基因編輯需求，CRISPR/Cas9的引導(dǎo)RNA有不同的產(chǎn)生方式，會對最終基因的編輯效果產(chǎn)生顯著影響。

2.1 單引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄

CRISPR/Cas9人工構(gòu)建的引導(dǎo)RNA的5′端1-20核苷酸與靶DNA序列互補(bǔ)，不能有額外的多個核苷酸序列，因此引導(dǎo)RNA最初都是由聚合酶III型啟動子（Pol III promoter）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。在植物過表達(dá)技術(shù)中應(yīng)用廣泛的II 型啟動子是一類表達(dá)強(qiáng)，在基因過表達(dá)中廣泛使用的一類生物體內(nèi)源啟動子，如CaMV 35S 啟動子、玉米泛素啟動子（Ubiquitin）啟動子等。但這類啟動子轉(zhuǎn)錄的RNA是前體結(jié)構(gòu)，如mRNA 前體，microRNA前體和一些小的核RNA前體等，這些非成熟的RNA前體會經(jīng)過體內(nèi)加工系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)5′ 加帽和3′加尾，并且切除內(nèi)含子。因此II型啟動子不能用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)中引導(dǎo)RNA的轉(zhuǎn)錄［15］。III型啟動子是轉(zhuǎn)錄5s RNA，tRNA和小的非編碼RNA的啟動子。在CRISPR/Cas9中常用的Pol III啟動子有U3和U6兩類，在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生引導(dǎo)RNA為U6，在植物中產(chǎn)生引導(dǎo)RNA為U3和U6，U3和U6啟動子在轉(zhuǎn)錄引導(dǎo)RNA產(chǎn)生基因編輯的頻率上沒有差別［2-3，6，16］。U3 啟動子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物第一個堿基固定是A，而U6啟動子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物第一個堿基固定是G，因此引導(dǎo)RNA的5′端序列需根據(jù)U3或U6的使用進(jìn)行調(diào)整，如5′GN（19）NGG 和 5′AN（19）NGG［17］。在使用 Pol III啟動子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生引導(dǎo)RNA時，通常一個U3或U6啟動子只能產(chǎn)生一個引導(dǎo)RNA分子去實(shí)現(xiàn)一個靶位點(diǎn)的切割。當(dāng)需要產(chǎn)生多個引導(dǎo)RNA時，需要將這類啟動子重復(fù)使用去驅(qū)動多個引導(dǎo)RNA產(chǎn)生［18］。

U3和U6啟動子在CRISPR/Cas9基因編輯中廣泛用于引導(dǎo)RNA的轉(zhuǎn)錄，但具有一定的局限性。U3和U6啟動子是組成型表達(dá)啟動子，不具備組織特異性表達(dá)，這導(dǎo)致引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生無法在時空上進(jìn)行調(diào)節(jié)，不能實(shí)現(xiàn)條件誘導(dǎo)性的基因編輯。生物體內(nèi)的U3和U6啟動子分布廣、種類多，不同種屬之間序列差異大，同一物種中的啟動子活性也不同。啟動子的有些調(diào)控元件位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游內(nèi)，容易導(dǎo)致克隆的啟動子序列不完整，影響啟動子活性［15］。近來也有研究報道通過RNA聚合酶II型啟動子轉(zhuǎn)錄一條包含Cas9 和引導(dǎo)RNA的轉(zhuǎn)錄本，這條轉(zhuǎn)錄本中的引導(dǎo)RNA可被RNaseIII途徑加工后，與Cas9結(jié)合在水稻中產(chǎn)生高頻率的基因編輯活性［19-20］。

2.2 多引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄

當(dāng) CRISPR/Cas9要對體內(nèi)多個靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)基因編輯時，需要產(chǎn)生多個引導(dǎo)RNA與目的序列位點(diǎn)結(jié)合。多個引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生最早是用U3或U6啟動子交替重復(fù)使用，每個啟動子對自身下游的引導(dǎo)RNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。采用此策略在水稻和擬南芥中可同時分別轉(zhuǎn)錄6個引導(dǎo)RNA產(chǎn)生，獲得16%的純和突變體的靶位點(diǎn)編輯頻率［21］。雖然這個方法可以得到多個靶位點(diǎn)的突變體，但利用U3/U6重復(fù)表達(dá)多個引導(dǎo)RNA有以下不足：（1）由于引導(dǎo)RNA長度很短，并且要求引導(dǎo)RNA的5′末端為A/G，3′末端需要為5個及以上的poly（T）作為終止信號，克隆構(gòu)建策略有限，無論是采用DNA合成還是多個片段拼接，引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄單元串聯(lián)的載體十分具有挑戰(zhàn)性。目前文章報道采用的策略均在Golden Gate的技術(shù)上做改進(jìn)，最多可將5個引導(dǎo)RNA表達(dá)單元裝入一個載體，而6個以上的引導(dǎo)RNA表達(dá)單元組裝效率很低［16］。（2）串聯(lián)重復(fù)的引導(dǎo)RNA表達(dá)單元包含啟動子后在300-600個堿基左右，其中只有與目的基因序列互補(bǔ)的20 個堿基作為Protospacer有變化，其余序列均為重復(fù)序列。過多的重復(fù)序列容易造成載體在細(xì)菌和農(nóng)桿菌中的不穩(wěn)定。（3）由于多引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)的串聯(lián)，容易在植物體內(nèi)誘發(fā)基因沉默，造成引導(dǎo)RNA的低水平或不表達(dá)。以上這些因素使U3或U6啟動子重復(fù)使用產(chǎn)生多個引導(dǎo)RNA的基因編輯技術(shù)存在很大的挑戰(zhàn)［21］。

近年來，多個引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中的一個研究熱點(diǎn)。在生物體內(nèi)存在可以從一個RNA轉(zhuǎn)錄本中產(chǎn)生多個RNA分子的機(jī)制，如多順反子mRNA前體在轉(zhuǎn)錄后加工過程中被RNA酶剪切后可產(chǎn)生多個獨(dú)立的引導(dǎo)RNA分子。因此，可以利用生物體內(nèi)的RNA剪切加工過程從一個RNA轉(zhuǎn)錄本中同時產(chǎn)生多個引導(dǎo)RNA分子。目前報道在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中利用3種RNA剪切過程實(shí)現(xiàn)多個引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生：來源于Pseudomonas aeruginosa的Csy4的RNA切割酶，tRNA序列介導(dǎo)的內(nèi)源RNA酶剪切和病毒來源的核酶剪切系統(tǒng)。Csy4作為外源RNA切割酶，多個引導(dǎo)RNA被其20個核苷酸的識別序列間隔開，Csy4識別這段序列并切割間隔序列的3′末端，可釋放兩個Csy4識別序列之間的引導(dǎo)RNA分子，產(chǎn)生的引導(dǎo)RNA的5′端沒有額外核苷酸存在而3′端帶有Csy4的20nt的識別序列［22］。2017年，有研究將Csy4通過2A肽與Cas9蛋白融合表達(dá)，引導(dǎo)RNA通過Csy4識別序列串聯(lián)，可在體內(nèi)通過能從一個RNA轉(zhuǎn)錄本上同時產(chǎn)生12個引導(dǎo)RNA分子［23］。生物體內(nèi)還存在一類tRNA加工的RNA 剪切加工系統(tǒng)，常用的是tRNAGly是一段77nt 的核苷酸形成的一個包含3個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的一段RNA序列，其5′端含有一個RnaseP的識別切割位點(diǎn)，3′端含有一個RnazeZ的識別切割位點(diǎn)，在體內(nèi)通過內(nèi)源核酸酶將tRNA序列的兩個位點(diǎn)切割從而釋放引導(dǎo)RNA。當(dāng)多個引導(dǎo)RNA通過在5′和3′端連接有77 nt 的tRNA序列進(jìn)行串聯(lián)時，核酸酶加工切割過程可從一個RNA分子上釋放多個引導(dǎo)RNA，產(chǎn)生的引導(dǎo)RNA的3′端經(jīng)RNaseZ切割后殘留6個tRNA序列的核苷酸而5′不含額外的核苷酸［24-25］。tRNAGly序列在動植物中均存在，介導(dǎo)的多個引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄釋放技術(shù)在CRISPR/Cas9技術(shù)中得到了廣泛使用，通過此方法實(shí)現(xiàn)了同時對動植物體內(nèi)多個位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯，有報道最多可一次產(chǎn)生8個引導(dǎo)RNA分子［23］。此外，與tRNAGly序列釋放引導(dǎo)RNA的過程類似，在引導(dǎo)RNA的5′端和3′端各加上一種核酶序列，5′端是Hammerhead（HH）type ribozyme，3′端 是 Hepatitis delta virus（HDV）ribozyme，這種結(jié)構(gòu)形成的引導(dǎo)RNA分子稱為 RGR（Ribozyme-gRNA-Ribozyme，RGR）。RGR可利用核酶序列間隔，將多個引導(dǎo)RNA分子串聯(lián)轉(zhuǎn)錄后，引導(dǎo)RNA兩側(cè)的核酶序列被體內(nèi)核酸酶識別并切除，從而釋放有活性的引導(dǎo)RNA分子，但這兩種核酶的切割活性較tRNA結(jié)構(gòu)要低很多［23］，并且在需要引入動物病毒的核酶序列，在植物應(yīng)用中有很大局限。但tRNA結(jié)構(gòu)不同，這兩種核酶在SP6啟動子介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄過程中，可被SP6 RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄過程中識別并切除［26］。

以上3種策略中，Csy4和tRNA介導(dǎo)的多個引導(dǎo)RNA在體內(nèi)產(chǎn)生并實(shí)現(xiàn)多靶位點(diǎn)的基因編輯頻率相當(dāng)，而遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HH ribozyme和HDV ribozyme核酶產(chǎn)生的引導(dǎo)RNA。有報道表明Csy4核酸酶不會對植物體產(chǎn)生負(fù)表型影響，而且Csy4的識別序列只有20個核苷酸，遠(yuǎn)短于tRNA的77個核苷酸序列，有利于載體的構(gòu)建和穩(wěn)定［23］。tRNA的切割加工是生物體的一個基本活性過程，因此tRNA介導(dǎo)的多個引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生可廣泛用于動植的基因編輯，是多位點(diǎn)CRISPR/Cas9基因編輯的一個研究熱點(diǎn)［15，23-25］。而 HH ribozyme 和 HDV ribozyme核酶能被SP6識別并切割，因此更適用于體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生多個引導(dǎo) RNA 的應(yīng)用［15，26］。

2.3 體外產(chǎn)生引導(dǎo)RNA

在CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中，Cas9和引導(dǎo)RNA可以在體外產(chǎn)生后組裝成蛋白核酸復(fù)合體（Ribonucleoproteins，RNPs），導(dǎo)入細(xì)胞體內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)DNA編輯。體外產(chǎn)生引導(dǎo)RNA主要由用商品化的T7體外轉(zhuǎn)錄試劑完成，引導(dǎo)RNA的DNA序列5′端含有T7啟動子序列和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)［27-28］。體外轉(zhuǎn)錄的引導(dǎo)RNA可以是單分子形式，也可以是CrRNA和TracrRNA兩個分子。引導(dǎo)RNA也由化學(xué)合成的方法在體外產(chǎn)生，常用的方法是固相基質(zhì)上如利用 2′-silyl，2′-bis-methylther等化學(xué)合成方法。但單引導(dǎo)RNA的分子長度接近100個核苷酸，合成的成本和難度大，因此通常采用CrRNA和TracrRNA兩個分子的形式［29］。

3 優(yōu)化引導(dǎo)RNA提高基因編輯效率

CRISPR/Cas9雖然廣泛應(yīng)用于各種動植物體的基因編輯，但在一些生物體中仍存在效率低的問題，如小麥等［30］。此外，同源重組介導(dǎo)的核苷酸定點(diǎn)插入和替換的效率依賴于Cas9的切割效率。群體中足夠多的雙鏈斷裂（Double strand break，DSB）是實(shí)現(xiàn)同源重組的必要條件，而引導(dǎo) RNA 5′端的序列結(jié)構(gòu)是影響同源重組效率的另一因素［31］。因此，提高CRISPR/Cas9的基因編輯效率對這項技術(shù)的廣泛和深入應(yīng)用有重要意義。引導(dǎo)RNA作為CRISPR/Cas9的重要組成之一，引導(dǎo)RNA的序列、高級結(jié)構(gòu)以及表達(dá)方式對CRISPR/Cas9的基因編輯效率有顯著影響［32］。

3.1 引導(dǎo)RNA序列組成對基因編輯效率的影響

引導(dǎo)RNA的序列由與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)的Protospacer和Scaffold 兩部分組成。5′端的1-20個核苷酸是與目標(biāo)序列互補(bǔ)的一段序列，其中的核苷酸組成會影響基因編輯效率，當(dāng)G和C出現(xiàn)頻率高而A出現(xiàn)頻率低，尤其是GC含量高于50%時，可以提高引導(dǎo)RNA序列與靶基因序列位點(diǎn)結(jié)合的穩(wěn)定性，提高Cas9的切割效率；尤其是靠近靶序列的PAM位點(diǎn)的核苷酸中，20位核苷酸偏好G而避免C，19位核苷酸避免C時，可顯著提高引導(dǎo)RNA產(chǎn)生的編輯效率。此外，引導(dǎo)RNA通常由RNA聚合酶III型的U3或U6啟動子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，RNA序列中連續(xù)4個及以上的尿嘧啶將成為這類啟動子的終止信號，可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的提前終止［33］。在引導(dǎo)RNA內(nèi)部位于Lower stem的第23-26位4個連續(xù)尿嘧啶序列UUUU［23，26-30］是U3或U6啟動子潛在的終止信號，當(dāng)這四個尿嘧啶分別被突變?yōu)锳，C，G時，均可提高CRISPR/Cas9的基因編輯效率，尤其是突變?yōu)镃和G時較A的基因編輯效率高很多；并且第26位的尿嘧啶突變?yōu)镃時，提高的編輯效率較其他3位的突變最為明顯［9］。這種優(yōu)化的引導(dǎo)RNA序列在水稻基因編輯中得到了應(yīng)用［14］。

3.2 引導(dǎo)RNA序列結(jié)構(gòu)對基因編輯效率的影響

引導(dǎo)RNA的二級結(jié)構(gòu)是被Cas9蛋白識別并產(chǎn)生功能的重要序列。利用熒光探針淬滅技術(shù)研究不同序列缺失的引導(dǎo)RNA與Cas9蛋白體外結(jié)合時發(fā)現(xiàn)，缺失第一個莖環(huán)（Nexus）將導(dǎo)致Cas9蛋白不能結(jié)合引導(dǎo)RNA，這與Cas9蛋白結(jié)合引導(dǎo)RNA的晶體結(jié)構(gòu)相吻合，缺失第2個莖環(huán)（Hairpin1）和第3個莖環(huán)（Hairpin2）時，Cas9蛋白結(jié)合引導(dǎo)RNA的效率要降低很多，尤其是與總RNA共同混合時尤其明顯。說明引導(dǎo)RNA的二級結(jié)構(gòu)是CRISPR/Cas9產(chǎn)生基因編輯的重要部分，還對引導(dǎo)RNA在細(xì)胞內(nèi)特異性被Cas9蛋白識別結(jié)合有作用［34］。應(yīng)用于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中人工創(chuàng)造的引導(dǎo)RNA序列中，雙鏈互補(bǔ)區(qū)的序列比天然crRNA：tracrRNA的雙鏈互補(bǔ)區(qū)截短了10個堿基對，目前關(guān)于引導(dǎo)RNA二級結(jié)構(gòu)優(yōu)化提高CRISRP/Cas9基因編輯效率的研究集中在這部分序列。當(dāng)延長這部分序列從1、3、5、8和10個堿基對時，發(fā)現(xiàn)延長5個堿基對時引導(dǎo)RNA的基因編輯效率可達(dá)到最大［9，35］。在水稻中，延長雙鏈結(jié)合區(qū)5個堿基對并疊加第26位的尿嘧啶突變?yōu)镃時，這種類型的引導(dǎo)RNA結(jié)構(gòu)比現(xiàn)有序列的基因編輯提高13倍［14］。此外，對引導(dǎo)RNA的3′端添加G3U3或G2U1的特定核苷酸序列，通過提高引導(dǎo)RNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性而提高CRISPR/Cas9的切割效率并降低脫靶率［36］。

3.3 RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄引導(dǎo)RNA對基因編輯效率的影響

在CRISPR/Cas9基因編輯中，引導(dǎo)RNA通常由RNA聚合酶III型轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，但由于這類啟動子的強(qiáng)度較常用的II型啟動子強(qiáng)度低，限制了CRISPR/Cas9的編輯效率。在多引導(dǎo)RNA產(chǎn)生中發(fā)展來的幾種多順反子RNA切割系統(tǒng)，可以使引導(dǎo)RNA的5′端不受RNA聚合酶III啟動子限制，而是用強(qiáng)度更大的RNA聚合酶II型啟動子轉(zhuǎn)錄引導(dǎo)RNA。在番茄原生質(zhì)體中，用CmYLCV（Cestrum Yellow Leaf Curling Virus promoter）啟動子驅(qū)動tRNAGly和Csy4介導(dǎo)的兩種引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄，對黃色熒光蛋白（Yellow fluorescent protein，YFP）的編輯效率比U6啟動子驅(qū)動的引導(dǎo)RNA要高2倍［21］。考慮到RNA聚合酶II型啟動子的35S 和Ubiquitin啟動子常用于驅(qū)動Cas9表達(dá)盒，為了避免載體含有重復(fù)的大片段，目前有多個RNA聚合酶II型啟動子以供引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄，除前文提到的植物病毒來源的CmYLCV啟動子，還有細(xì)菌來源的M24和Nos以及植物來源的 AtUbi10，OsAct1，PvUbi1和 PvUbi2等， 甚 至有組織特異性的啟動子如Arabidopsis Ec1.2 和YAO promoter可供引導(dǎo)RAN實(shí)現(xiàn)植物卵細(xì)胞，囊胚和花粉中的特異表達(dá)［21，37］。

4 總結(jié)與展望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為基因編輯重要的一個工具，已經(jīng)廣泛用于各種生物體的特定核苷酸的缺失和改變，以及特定基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。引導(dǎo)RNA作為CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的核心元件之一，對其序列和結(jié)構(gòu)的研究不僅加深人們認(rèn)識CRISPR/Cas9的自然分類、工作原理，而且為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)化和拓展具有重要價值［38-39］。最近報道在引導(dǎo)RNA的3′端添加用于同源重組介導(dǎo)的RNA形式的供體序列，在Cas9蛋白產(chǎn)生的雙鏈斷裂缺口處完成供體RNA鏈與目的DNA序列鏈的置換，可以大幅提高核苷酸的定點(diǎn)編輯的效率［40］。此外，引導(dǎo)RNA的保守序列部分為新CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)掘提供重要的信息和證據(jù)［41］。