何向東 夏憶 吉格莫體 王會 字向東

（西南民族大學(xué)動物科學(xué)國家民委重點實驗室，成都 610041）

低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia inducible factor，HIF）是動物低氧生理反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，由α和β亞基組成的異二聚體，其中α亞基受氧調(diào)節(jié)，是調(diào)節(jié)HIF活性的功能亞單位。目前已知的α亞基有HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α三種。在哺乳動物處于低氧環(huán)境下，HIF-1α和HIF-2α因子的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄潛力均顯著提高［1］，進而調(diào)控HIF下游基因，特別是關(guān)于糖酵解相關(guān)基因（如GLUT1、LDHA和VEGF）表達，通過增加糖酵解效率、促進血管生成和增加葡萄糖轉(zhuǎn)運等途徑來維持其在缺氧環(huán)境中的生存和對抗缺氧損傷［2］。低氧分壓通過HIF-1α影響卵母細胞的成熟、黃體的形成與早期胚胎的發(fā)育［3］，但是，慢性低氧也會引起動物繁殖能力下降［4］。HIF-2α又稱內(nèi)皮 PAS蛋白 1（EPAS-1），刺激胚胎分泌兒茶酚胺，調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育［5］。小鼠子宮缺失HIF-2α會造成小鼠不孕不育，而小鼠子宮缺失HIF-1α會造成小鼠繁殖能力下降［6］。雖然世居高原的動物對高原低氧有一定的適應(yīng)能力，但雌性高原鼠兔（Ochotona curzoniae）的窩產(chǎn)仔數(shù)也隨著低氧程度的提高而下降［7］。目前，動物繁殖機能對低氧環(huán)境適應(yīng)其分子調(diào)控機制的有待深入研究。

牦牛（Bos grunniens）是生活在青藏高原高海拔低氧地區(qū)的物種，是高原人民的主要生活資料和生產(chǎn)資料［8］。牦牛為季節(jié)性發(fā)情動物，生殖系統(tǒng)發(fā)育緩慢，性成熟晚，繁殖性能低［9］。黃牛則主要分布在海拔2 000 m以下的地區(qū)，為常年發(fā)情動物［10］。因此，本研究以母牦牛和母黃牛為研究對象，運用RT-qPCR 技術(shù)對HIF-1αmRNA 與HIF-2αmRNA 在兩物種生殖軸的表達差異進行分析，探討牦牛生殖機能對高原低氧環(huán)境的適應(yīng)調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 在2017年10月，實驗選取5頭4-5歲紅原（海拔3 000 m）放牧飼養(yǎng)、處于卵泡期的健康母牦牛和5頭4-5歲巴中（海拔1 500 m）放牧飼養(yǎng)、處于卵泡期的健康母黃牛，于四川省成都市青白江唐家寺屠宰場現(xiàn)場屠宰。使用無菌剪刀剪取下丘腦、腦垂體、卵巢、輸卵管和子宮組織。組織樣用生理鹽水沖洗干凈，投入液氮罐，快速運回實驗室，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑、儀器 Trizol Reagent為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；DNA Marker DL2000，2×Taq PCR Master mix為上海天根公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit）為Thermo Scientific公司產(chǎn)品；DH5α感受態(tài)細胞為康迪生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；克隆載體pMD-19Vector、IPTG、X-Gal和氨芐青霉素均為大連寶TaKaRa生物工程有限公司產(chǎn)品；Green Supermix 為 DBI?BIOSCIENCE公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒（AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit）為北京Axygen公司產(chǎn)品；RT-qPCR儀（CFX6）為美國Bio Rad公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)（GEL DOC2000）為美國Bio Rad公司產(chǎn)品；PCR儀（ETC811）為蘇州東盛興業(yè)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI公布的牦牛HIF-1α（ 登 錄 號 ：AY621118.1）、HIF-2α（ 登 錄號：KJ617390.1）和內(nèi)參基因GAPDH（登錄號：EU195062.1）設(shè)計熒光定量引物（表1），引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

表1 HIF-1α、HIF-2α和GAPDH熒光定量引物

1.2.2 總RNA提取和cDNA第一鏈合成 將分別采集的牦牛和黃牛下丘腦、腦垂體、卵巢、輸卵管和子宮組織各取0.5 g左右放入預(yù)先用液氮冷卻的研缽內(nèi)，用研磨棒將各組織研磨成白色粉末狀，采用Trizol法分別提取牦牛和黃牛的生殖軸的總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性并用紫外分光光度計檢測RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄前檢測RNA的濃度為100 ng/μL。cDNA合成采用Thermo Scientific試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄程序按照說明書進行。反轉(zhuǎn)錄后，將得到的cDNA分別作為常規(guī)PCR和RT-qPCR模板，置于-20℃冰箱備用。

1.2.3 常規(guī)PCR檢測引物特異性 以牦牛和黃牛下丘腦cDNA為模板，利用常規(guī)PCR檢測HIF-1α、HIF-2α和GAPDH引物特異性。常規(guī)PCR反應(yīng)體系為 25 μL ：Taq 酶（5 U/μL）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上游引物（100 μmol/μL）各 1 μL，cDNA1 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性 30 s；退火30 s（溫度見表1）；72℃延伸30 s，循環(huán)39次；72℃終延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將0.5 μL pMD-19Vector、4.5 μL純化回收產(chǎn)物和5 μL Solution于16℃金屬浴中反應(yīng)過夜，保證連接徹底。連接后的產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化100 μL宿主菌E. coliDH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)過冰浴、熱激活等步驟后均勻涂布于含有0.1%的氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基上，涂布至干后封口倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。在超凈工作臺中，用滅菌槍頭挑取白色單克隆菌落于含有Amp（濃度為0.1%）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min。震蕩培養(yǎng)8 h至菌液渾濁。取1 μL菌液作為模板進行PCR擴增反應(yīng)及電泳檢測鑒定后，最后挑選含目的基因片段的陽性單克隆菌液送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.4 制備標準品 將PCR產(chǎn)物做膠回收作為制備標準品的模板，回收步驟按說明書進行，進行倍比稀釋制作標準品，方法參照［11］。

1.2.5 繪制標準曲線 依次從稀釋5個梯度的標準品中各取2 μL作為cDNA模板進行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系25 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物各1.5 μL，SYBR Green Supermix 12.5 μL，ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，退火30 s（溫度見表1），72℃延伸30 s，循環(huán)40次。

1.2.6 目的基因組織表達分析 設(shè)置qRT-PCR溫度梯度，以便確定最佳退火溫度和優(yōu)化實驗方案，檢測HIF-1α和HIF-2α mRNA分別在牦牛和黃牛的繁殖相關(guān)組織表達差異，反應(yīng)體系25 μL：酶12.5 μL，ddH2O 7.5 μL，上、下游引物各 1.5 μL，cDNA 2 μL，反應(yīng)程序和1.2.5一致。每個樣品作3個重復(fù)。熒光定量結(jié)果分析方法參照［12］。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析，結(jié)果用“平均值±標準誤（Mean±SE）表示，采用One-way ANOVA和t-檢驗進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 牦牛和黃牛不同組織總RNA提取

提取的RNA經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，28S RNA和18S RNA條帶清晰可見。說明提取的總RNA完整性強，無降解；分光光度計測得樣品OD260/ OD280比值均在1.8-2.0之間，說明提取總RNA純度高。這兩者結(jié)果表明RNA均符合要求，可以用于后續(xù)實驗。

2.2 常規(guī)PCR檢測引物特異性

取PCR產(chǎn)物10 μL加入上樣孔，110 V電泳30 min，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，在瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)清晰觀察到在膠上173 bp和140 bp處均為單一條帶，說明引物的特異性好且與預(yù)期的片段長度相符。將測序結(jié)果與NCBI公布的序列進行比對，結(jié)果（圖1）表明，這6段序列與NCBI公布序列完全一致?？梢杂糜趯嶒灪罄m(xù)工作。

圖1 HIF-1α、HIF-2α和GAPDH基因在黃牛和牦牛擴增產(chǎn)物

2.3 RT-qPCR檢測目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率

以制備好的標準品作為模板，RT-qPCR自動生成HIF-1α、HIF-2α和GAPDH基因的標準曲線和熔解曲線。由標準曲線可知R2值（相關(guān)系數(shù)）均大于或等于0.998，計算擴增效率［12］分別為2.02、1.98和1.98，滿足實驗要求；優(yōu)化RT-qPCR后，各基因溶解曲線形成單峰（圖2），表明符合RT-qPCR要求?？梢杂糜趯嶒灪罄m(xù)工作。

2.4 目的基因組織表達量分析

RT-qPCR檢測結(jié)果表明HIF-1αmRNA、HIF-2αmRNA在牦牛生殖軸均有表達，但在各個組織中存在較大差異。HIF-1αmRNA在牦牛輸卵管表達量最高，在下丘腦、腦垂體、卵巢和子宮相對表達量較低。HIF-1αmRNA在牦牛腦垂體、輸卵管表達量均極顯著高于黃牛（P＜0.01），而兩物種在下丘腦、子宮和卵巢的表達差異均不顯著（圖3）。HIF-2αmRNA在牦牛腦垂體表達量最高。HIF-2αmRNA在牦牛腦垂體表達量極顯著高于黃牛（P＜0.01），在輸卵管表達量顯著高于黃牛（P＜0.05），而兩物種在下丘腦、卵巢和子宮的表達差異均不顯著（圖4）。

圖2 HIF-1α、HIF-2α和GAPDH溶解曲線

圖3 HIF-1α mRNA在黃牛和牦牛不同組織的表達量

圖4 HIF-2α mRNA在黃牛和牦牛組織表達譜

3 討論

HIF是誘導(dǎo)低氧基因和修復(fù)細胞氧內(nèi)環(huán)境的核心調(diào)節(jié)因子，通過增強轉(zhuǎn)錄水平參與缺氧反應(yīng)基因的調(diào)控，從而使機體對低氧刺激產(chǎn)生復(fù)雜反應(yīng)。HIF-1α 主要作為應(yīng)激性低氧調(diào)控因子來調(diào)節(jié)細胞活動，HIF-2α主要負責細胞的長期性低氧適應(yīng)［13］。HIF能夠提高滋養(yǎng)細胞的耐氧能力，而滋養(yǎng)細胞利于侵襲子宮蛻膜［14］。HIF-1α與胎盤轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，胚胎在子宮內(nèi)膜處于生理性缺氧狀態(tài)時，HIF對于胚胎發(fā)育期間的造血前體細胞增殖和存活，低氧條件下對滋養(yǎng)細胞增殖及其在子宮著床有重要的調(diào)控作用［15］。然而，有研究表明在極度缺氧的狀況下，HIF-1α等分子的作用不足以緩沖低氧的損害，使滋養(yǎng)細胞出現(xiàn)嚴重缺氧、微管骨架結(jié)構(gòu)改變和侵襲能力明顯下降，使侵襲子宮蛻膜層過淺，對滋養(yǎng)層細胞有明顯的抑制作用［16］。在高海拔低氧條件下，高原綿羊黃體中HIF-1α和VEGF基因的表達量顯著升高，增加黃體血管分布，提高黃體功能，從而提高對低氧條件的適應(yīng)能力［17］。對牛的初始黃體和黃體顆粒細胞的研究證明，HIF通過PKA信號途徑調(diào)節(jié)黃體細胞的增殖和固醇類激素的生成［18］，以提高對高原低氧的適應(yīng)能力。但有研究表明長時間生活在高海拔低氧的動的繁殖能力都降低［7，17，19］。雌性動物生殖活動受到下丘腦-垂體-卵巢軸（Hypothalamus-pituitary-ovaries，HPO）調(diào)控，輸卵管是受精和早期卵裂的場所，而子宮是胚胎和胎兒發(fā)育的場所，因此，本研究采用RT-qPCR法檢測了HIF-1αmRNA和HIF-2αmRNA在高海拔低氧環(huán)境條件下生存的牦牛與低海拔條件下生存的黃牛的HPO、輸卵管和子宮組織的表達量差異，對揭示母牦牛生殖機能對高原低氧環(huán)境適應(yīng)的分子調(diào)控機制具有重要意義。

本實驗表明，HIF-1αmRNA在牦牛和黃牛下丘腦、腦垂體、輸卵管、卵巢和子宮中都有表達說明該基因無組織表達特異性［20］，同時HIF-2αmRNA在牦牛卵巢表達，但這與Xiong等［21］研究認為該基因在卵巢中無表達研究結(jié)果不一致，推測可能是實驗方法不同引起結(jié)果不同，也說明兩基因?qū)φ{(diào)節(jié)動物繁殖機能有不可忽略的作用。HIF-1αmRNA在牦牛輸卵管表達量最高，輸卵管是哺乳動物受精和早期胚胎發(fā)育的場所，推測牦牛輸卵管對低氧應(yīng)激敏感性極高。下丘腦和腦垂體影響動物FSH（卵泡刺激素）和LH（促黃體素）的分泌，對動物生殖活動有重要的調(diào)節(jié)作用，有研究證明該基因在動物處于低氧狀態(tài)下會誘導(dǎo)產(chǎn)生FSH，促進卵泡在低氧環(huán)境中成熟［22］，本實驗結(jié)果表明，HIF-1αmRNA在牦牛腦垂體表達量極顯著高于黃牛（P＜0.01）且在牦牛下丘腦表達量最低，推測在牦牛處于低氧環(huán)境中，該基因可能引起牦牛較低的繁殖力。HIF-2αmRNA在牦牛腦垂體表達量極顯著高于黃牛（P＜0.01），表明低氧環(huán)境可能通過刺激牦牛腦垂體分泌相關(guān)激素調(diào)節(jié)促紅細胞生成素的合成和分泌，同時也會影響繁殖機能［23-25］。HIF-1α、HIF-2αmRNA 在牦牛的表達量均高于黃牛，而HIF對促性腺激素釋放激素、雌激素和促黃體素等生殖激素有促進作用［26］，推測低氧誘導(dǎo)因子在牦牛處于低氧環(huán)境中對維持牦牛繁殖性能和調(diào)控牦牛繁殖相關(guān)激素有重要作用［26］。HIF-2α會參與促紅細胞生成素的合成［23-25］，而該生成素會影響輸卵管中包括雌激素等多種激素的分泌［27］，本實驗中HIF-2αmRNA在輸卵管表達量顯著高于黃牛（P＜0.05），推測該基因會通過促紅細胞生成素調(diào)控牦牛生殖激素的分泌，影響牦牛生殖活動，然而，動物長期的HIF高水平對其生殖能力有不良影響［4］。另外，HIF-1α、HIF-2αmRNA 表達量均高于牦牛，說明HIF在缺氧的狀態(tài)下會比非缺氧狀態(tài)下更加活躍［28］，而這種活躍程度是否會造成兩物種的繁殖差異可做進一步研究。另外，本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α、HIF-2αmRNA在季節(jié)性發(fā)情的母牦牛與全年發(fā)情的黃牛在下丘腦、卵巢和子宮的表達差異均不顯著，然而，本實驗的牦牛樣品均采自發(fā)情季節(jié)，因此，兩基因在牦牛季節(jié)性乏情期與發(fā)情季節(jié)的表達量差異可做進一步研究。

4 結(jié)論

長期處于低氧環(huán)境下的牦牛的腦垂體和輸卵管中HIF-1α、HIF-2αmRNA表達量高于黃牛，這可能是牦牛生殖機能對高原低氧環(huán)境適應(yīng)的重要調(diào)控機制。