于爽 李帥 李海濤 劉榮梅 高繼國(guó)

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2. 牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，牡丹江 157011）

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）是革蘭氏陽(yáng)性菌，其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生分泌到胞外的營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白（Vegetative insecticidal proteins，簡(jiǎn)稱 VIPs）［1］和分泌型殺蟲(chóng)蛋 白（Secreted insecticidal protein， 簡(jiǎn) 稱 SIPs）［2］，母細(xì)胞在釋放芽胞時(shí)也可以產(chǎn)生殺蟲(chóng)晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，簡(jiǎn)稱ICPs）。殺蟲(chóng)晶體蛋白主要分為Cry 和Cyt 兩類，圍繞Bt Cry 殺蟲(chóng)晶體蛋白的研究非常廣泛，包括含有新cry基因菌株的發(fā)掘、cry基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制、Cry 蛋白的結(jié)構(gòu)與功能及Cry 蛋白在田間應(yīng)用的問(wèn)題等［3］。隨著Cry蛋白在微生物工程菌和轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物中的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致一些昆蟲(chóng)對(duì)Cry蛋白產(chǎn)生耐藥性及抗性［4-5］。

營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白在氨基酸序列的進(jìn)化上與Cry蛋白沒(méi)有同源性，且殺蟲(chóng)位點(diǎn)與Cry蛋白也沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系［6-7］。Vips作為第二代生物殺蟲(chóng)劑對(duì)鱗翅目和雙翅目具有廣譜性，可以單獨(dú)或與Cry蛋白結(jié)合來(lái)預(yù)防或延緩昆蟲(chóng)抗性的產(chǎn)生，擴(kuò)大殺蟲(chóng)譜［8-10］，是害蟲(chóng)治理的新策略［11］。

目前已經(jīng)公布的vip基因根據(jù)它們的序列相似性分為四類，分別是vip1、vip2、vip3和vip4，其中vip3的研究較為深入［10，12］。Bt毒素委員會(huì)記載的有65 個(gè)vip3Aa，2 個(gè)vip3Ab，1 個(gè)vip3Ac，6 個(gè)vip3Ad，1 個(gè)vip3Ae，4 個(gè)vip3Af，15 個(gè)vip3Ag，2 個(gè)vip3Ah，1 個(gè)vip3Ai，2個(gè)vip3Ba，3個(gè)vip3Bb和 4 個(gè)vip3Ca（http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html）。已有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)基因工程技術(shù)改造已有的抗蟲(chóng)基因可以改變蛋白的殺蟲(chóng)活性或蛋白殺蟲(chóng)譜［13-14］。人工交換Cry1Ab和Cry1C的DomainⅢ構(gòu)建了一個(gè)新的Cry蛋白（1Ab-1Ab-1C），該蛋白對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性比單純Cry1Ab和Cry1C殺蟲(chóng)活性高出十倍以上［15］。而Cry1Ab、Cry1Ah 的結(jié)構(gòu)域交換后與出發(fā)蛋白相比，雜合蛋白 AhAhAb 喪失了對(duì)棉鈴蟲(chóng)殺蟲(chóng)活性，降低了對(duì)玉米螟、小菜蛾殺蟲(chóng)活性。將Cry3Aa的DomainⅠ和Ⅱ與Cry1Ab的DomainⅢ嵌合獲得的新蛋白能夠?qū)τ衩赘炄~甲產(chǎn)生毒殺作用，而Cry3Aa和Cry1Ab對(duì)其沒(méi)有活性［16］。而對(duì)vip的基因改造研究較少。

Vip3Aa蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾等鱗翅目昆蟲(chóng)具有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性［17］。Vip3Ad 對(duì)許多害蟲(chóng)沒(méi)有殺蟲(chóng)活性［18］。本研究利用重疊PCR的方法，通過(guò)比較Vip3Aa39與Vip3Ad蛋白的功能域，構(gòu)建了三種vip3AaAdAa型嵌合基因，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)嵌合蛋白，并測(cè)定了其對(duì)甜菜夜蛾的殺蟲(chóng)活性。旨在為深入了解Vip3A殺蟲(chóng)蛋白關(guān)鍵活性區(qū)域，進(jìn)一步揭示 Vip3A的殺蟲(chóng)機(jī)理提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 分別攜帶vip3Aa39和vip3Ad基因的pET21b質(zhì)粒、E. coliBL21感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)載體pET21b由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 膠回收試劑盒與質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó) Axygen 公司，酶類購(gòu)自TaKaRa公司，其它試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成及基因克隆測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：Yeast extract 0.5%，NaCl 1%，Tryptone 1%，pH調(diào)為7.0。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中按1.3%的比例加入瓊脂，121℃濕熱滅菌20 min。

1.1.4 供試?yán)ハx(chóng) 甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）蟲(chóng)卵均購(gòu)自河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司。待其產(chǎn)卵后，置于鋪有吸水紙的塑料盒中，人工氣候箱保持相對(duì)濕度在60%，溫度30℃，待其孵化，初孵幼蟲(chóng)供生物測(cè)定使用。

1.2 方法

1.2.1 嵌合基因片段的克隆Vip3AaAdAa基因是由vip3Aa39提供前段、后段序列，vip3Ad提供部分中間序列，拼接得到的嵌合基因。通過(guò)比對(duì)Vip3Aa39與Vip3Ad氨基酸序列，選取部分保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了5對(duì)中間引物（JB2F、JB2R、JB3F、JB3R、JB4F、JB4R、JB5F、JB5R、JB6F和JB6R）及2對(duì)全長(zhǎng)引物（39F、39R和DF、DR），在全長(zhǎng)引物中分別加入了BamHI和SalI酶切位點(diǎn)（下劃線），見(jiàn)表1。參考重疊延伸PCR法進(jìn)行片段的互換［19］，用KOD高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，將重組基因與pET21b質(zhì)粒分別雙酶切后4℃連接過(guò)夜，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)，挑取陽(yáng)性克隆子送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和DNAMAN軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)。

以嵌合基因vip3AaAdAa1的構(gòu)建為例，先以本實(shí)驗(yàn)室保存的pET-Vip3Aa39質(zhì)粒為模板，引物39F/JB2R、JB3F/39R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到vip3Aa39的0-354、810-2370序列片段vaq1、vah1；繼續(xù)以pET- Vip3Ad質(zhì)粒為模板，用引物 DF /JB3R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到vip3Ad的0-810序列片段vDq1；切膠純化后的產(chǎn)物vah1、vDq1為模板，通過(guò)引物 DF/39R 進(jìn)行融合擴(kuò)增，得到vipD391基因；以vipD391基因?yàn)槟０?，JB2F/39R為引物，擴(kuò)增得到vDM391；最后以vaq1和vDM391為模板，用引物 39F /39R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到的嵌合基因即為vip3AaAdAa1。vip3AaAdAa2、vip3AaAdAa3的構(gòu)建見(jiàn)圖1和表2。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

圖1 嵌合基因的構(gòu)建

1.2.2 嵌合蛋白的表達(dá) 將3個(gè)含有嵌合基因的重組質(zhì)粒以及pET-Vip3Aa39和pET-Vip3Ad質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21（DE3）菌株的感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行誘導(dǎo)IPTG表達(dá)蛋白，收集誘導(dǎo)物，離心，棄上清，用20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液懸浮細(xì)胞并進(jìn)行超聲波破碎，取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析［20］。

1.2.3 甜菜夜蛾的生物活性測(cè)定 將粗提蛋白用20 mmol/L Tris-HCl稀釋成不同的濃度，且取3.0 mL待測(cè)樣品溶液加入到30 g飼料中混勻，室溫晾置蒸發(fā)多余水分；分裝于已消毒的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；將初孵幼蟲(chóng)接于24孔板中，每孔一頭；放置在27℃的人工氣候箱中培養(yǎng)，光周期為14∶10，濕度控制在65%左右。培養(yǎng)7 d后分別調(diào)查死、活蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算死亡率。

表2 嵌合基因合成模板與引物

1.2.4 胰蛋白酶消化 將3個(gè)嵌合蛋白與Vip3Aa39與Vip3Ad蛋白用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液定量到300 μg/mL。為確定嵌合蛋白的消化時(shí)間，先對(duì)Vip3Aa39與Vip3Ad蛋白進(jìn)行不同時(shí)間下的胰蛋白酶（0.1 mg/mL）處理，按胰蛋白酶與定量后蛋白1∶10的比例加入1.5 mL EP管中?？焖倩靹蚝蠹尤?7℃水浴鍋中溫育。在溫育5 min后，快速加入上樣緩沖液，沸水下變性10 min。然后進(jìn)行SDSPAGE電泳。

2 結(jié)果

2.1 嵌合基因的獲取

用KOD高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，將重組基因與pET21b質(zhì)粒分別雙酶切后連接過(guò)夜，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)，挑取陽(yáng)性克隆子送測(cè)序，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和DNAMAN軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)證明插入片段大小正確，長(zhǎng)度為2 370 bp（圖 2）。

圖2 3種嵌合基因與初始基因的PCR鑒定

2.2 嵌合蛋白的SDS-PAGE分析

將3個(gè)含有嵌合基因的重組質(zhì)粒以及pETVip3Aa39和pET-Vip3Ad質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21（DE3）菌株的感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。SDS-PAGE 結(jié)果（圖3）表明，在經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物在分子量約為 88 kD 處有明顯的特異性表達(dá)條帶，與理論推算基本相符。

圖3 3種嵌合基因和初始基因在BL21中的蛋白表達(dá)

2.3 5種蛋白對(duì)甜菜夜蛾的殺蟲(chóng)活性

將Vip3Aa39、Vip3Ad和3種嵌合蛋白對(duì)甜菜夜蛾初孵幼蟲(chóng)進(jìn)行生物活性測(cè)定，校正死亡率如表3。Vip3Aa39和3種嵌合蛋白對(duì)甜菜夜蛾具有較高的殺蟲(chóng)活性，而Vip3Ad對(duì)甜菜夜蛾沒(méi)有活性；嵌合蛋白Vip3AaAdAa1和Vip3AaAdAa3的校正死亡率均低于Vip3Aa39，且差異顯著，其中Vip3AaAdAa1蛋白的校正死亡率比Vip3Aa39低76.9%，Vip3AaAdAa3蛋白的校正死亡率比Vip3Aa39低51.3%，而Vip3Aa-AdAa2蛋白與Vip3Aa39校正死亡率差異不顯著。

表3 5種蛋白對(duì)甜菜夜蛾的生物活性（7 d）

通過(guò)蛋白對(duì)甜菜夜蛾致死中濃度LC50的測(cè)定表明（表 4），Vip3Aa39、Vip3AaAdAa1和 Vip3AaAd-Aa3對(duì)甜菜夜蛾具有比較高的殺蟲(chóng)活性，Vip3AaAd-Aa1蛋白的LC508.227μg/mL，比Vip3Aa39的LC50升高了2.7倍；Vip3AaAdAa3蛋白的LC505.452 μg/mL，比Vip3Aa39升高了1.4倍，且差異顯著，可見(jiàn)嵌合蛋白Vip3AaAdAa1和Vip3AaAdAa3的殺蟲(chóng)活性均低于Vip3Aa39；而Vip3AaAdAa2蛋白的活性與Vip3Aa39差異不顯著。

2.4 胰蛋白酶敏感性分析

將3個(gè)嵌合蛋白用胰蛋白酶處理5 min發(fā)現(xiàn)，88 kD的蛋白條帶消化后均得到62 kD的消化條帶（圖 4）。

表4 4種蛋白對(duì)甜菜夜蛾的致死中濃度

圖4 胰蛋白酶處理后的嵌合蛋白和初始蛋白SDS-PAGE圖

3 討論

蘇云金芽胞桿菌營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白已被用于作物保護(hù)和延緩對(duì)現(xiàn)有殺蟲(chóng)性Cry毒素的抗性。然而，人們對(duì)Vip3A的行為或作用機(jī)制知之甚少，也不清楚其結(jié)構(gòu)模型［21］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，C末端缺失154個(gè)氨基酸可使Vip3A蛋白失去對(duì)甜菜夜蛾和斜紋夜蛾的殺蟲(chóng)活性，而對(duì)玉米螟的殺蟲(chóng)活性僅僅稍有降低［22］。Vip3A蛋白由～789個(gè)氨基酸組成，Vip3Ad與Vip3Aa39的氨基酸相似性為85%，差異性較大的部分集中在后半段。

本研究通過(guò)這兩個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)互換獲得了3個(gè)嵌合蛋白，并對(duì)甜菜夜蛾進(jìn)行抗蟲(chóng)性分析，結(jié)果表明，將Vip3Aa39的118-210氨基酸片段用Vip3Ad的對(duì)應(yīng)片段替換后殺蟲(chóng)活性明顯下降，嵌合蛋白Vip3AaAdAa1與Vip3Aa39相比僅有3個(gè)氨基酸差異，用纈氨酸（V）替代了134位的丙氨酸（A），用甲硫氨酸（M）替代了176位的異亮氨酸（I），用脯氨酸（P）替代了201位的絲氨酸（S）；將Vip3Aa39的210-345氨基酸片段用Vip3Ad的對(duì)應(yīng)片段替換后殺蟲(chóng)活性與Vip3Aa39相比無(wú)明顯差異，Vip3AaAdAa2與Vip3Aa39相比也有3個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)，用天冬酰胺（N）替代了338位的纈氨酸（V）和342位的天冬氨酸（D），用蘇氨酸（T）替代了345位的丙氨酸（A）；Vip3AaAdAa3是將Vip3Aa39的455-632氨基酸片段用Vip3Ad的對(duì)應(yīng)片段替換，互換后有36個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生改變，殺蟲(chóng)活性與Vip3Aa39相比下降了1.4倍。3個(gè)嵌合蛋白的殺蟲(chóng)活性與Vip3Aa39相比有所改變，證明新的序列插入改變了殺蟲(chóng)活性，活性改變的原因還需要繼續(xù)研究。

在敏感昆蟲(chóng)腸液或Trypsin的作用下Vip3A蛋白能水解成分子量分別為62、45、33及22 kD的4條主帶，其中62 kD片段能與甜菜夜蛾的刷狀緣膜細(xì)胞（BBMV）相結(jié)合，形成離子孔道進(jìn)行穿孔，誘發(fā)靶標(biāo)昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核溶解，導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡［23］。研究表明，3種嵌合蛋白和Vip3Aa、Vip3Ad均表達(dá)88 kD的蛋白，經(jīng)胰蛋白酶消化后均出現(xiàn)62 kD的蛋白條帶。62-66 kD的片段是Vip3Aa蛋白的活性中心。Vip3A蛋白既可被敏感昆蟲(chóng)的中腸液消化產(chǎn)生蛋白片段，同樣也可被不敏感昆蟲(chóng)的中腸液消化產(chǎn)生同樣的蛋白條帶，但是活化后的Vip3A蛋白對(duì)非敏感昆蟲(chóng)依然沒(méi)有毒性［24］。這說(shuō)明活化只是Vip3A毒素發(fā)揮作用的開(kāi)始，后續(xù)還有很復(fù)雜的過(guò)程。

4 結(jié)論

利用重疊PCR的方法，通過(guò)比較對(duì)甜菜夜蛾具有高活性的Vip3Aa與無(wú)殺蟲(chóng)活性Vip3Ad蛋白的功能域，成功構(gòu)建了3種vip3AaAdAa型嵌合基因，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)嵌合蛋白。結(jié)果顯示，嵌合蛋白Vip3AaAdAa1和Vip3AaAdAa3對(duì)甜菜夜蛾具有比較高的殺蟲(chóng)活性，Vip3AaAdAa3蛋白的LC50值比Vip3Aa39增加了1.4倍，而Vip3AaAdAa1蛋白的LC50值比Vip3Aa39增加了2.7倍，導(dǎo)致嵌合蛋白Vip3AaAdAa1和Vip3AaAdAa3的殺蟲(chóng)活性均低于Vip3Aa39；Vip3AaAdAa2的殺蟲(chóng)活性與Vip3Aa39差異不顯著。