楊丙曄，李瑩，陳仲巍，*

（1.廈門醫(yī)學(xué)院廈門市醫(yī)用海洋天然產(chǎn)物與細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361023；2.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361005）

基因的表達(dá)在個(gè)體發(fā)育的不同階段以及不同的組織甚至細(xì)胞類型中是不同的，也叫基因表達(dá)的時(shí)空差異[1]。對(duì)一個(gè)基因的時(shí)空表達(dá)譜進(jìn)行研究分析，是研究一個(gè)未知基因功能的基礎(chǔ)，原位雜交技術(shù)從1969年創(chuàng)立以來已經(jīng)分化成兩個(gè)大的方面的應(yīng)用，整體原位雜交和組織切片原位雜交。整體原位雜交主要用于檢測(cè)特定基因在生物體的不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)位置的分析，組織切片原位雜交主要用于檢測(cè)基因在生物體的組織或細(xì)胞中的特定位置的表達(dá)分析，兩者可以相輔相成地對(duì)基因表達(dá)特異器官或組織定位進(jìn)行分析，進(jìn)而將基因的功能與生物體的發(fā)育過程相聯(lián)系[2]。定量即時(shí)聚合酶連鎖反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）主要有半定量 RT-PCR，實(shí)時(shí)定量RT-PCR 和競(jìng)爭性定量RT-PCR 3 種，其中實(shí)時(shí)定量RT-PCR 以其特異性強(qiáng)和自動(dòng)化高的特點(diǎn)得到廣泛的應(yīng)用[3]。本研究利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR 對(duì)SMRP1 在福建牡蠣不同發(fā)育階段幼體和不同組織器官的特異性表達(dá)進(jìn)行研究，繼而用原位雜交技術(shù)對(duì)福建牡蠣不同發(fā)育階段幼體和高表達(dá)組織中進(jìn)行定位研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

熒光定量Mix：美國Thermo 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：日本TaKaRa 公司；TRIzol 試劑、抗地高辛抗體：美國Roche 公司；NBT/BCIP 顯色試劑盒：中國索萊寶生物公司。

Gemini AS 自動(dòng)組織脫水機(jī)、ASP300S 自動(dòng)染色機(jī)：Thermo Fisher；EG1140 石臘包埋機(jī)、RM2235 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)：Leica；YKN-ECA-FZ01 雜交爐：Midwest；BX53多功能顯微鏡：Olympus。

1.2 SMRP1基因在牡蠣幼體不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組文庫表達(dá)分析

通過對(duì)福建牡蠣幼體5個(gè)不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組文庫比對(duì)分析獲得SMRP1 基因序列。使用Bioedit 軟件，從實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建獲得的福建牡蠣幼體5個(gè)不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組文庫數(shù)據(jù)中搜索SMRP1 基因的有效序列，依據(jù)SMRP1 基因在轉(zhuǎn)錄組文庫中的有效序列制作SMRP1 基因在福建牡蠣幼體6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)圖。

1.3 SMRP1基因在牡蠣幼體不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的qRT-PCR表達(dá)分析

從育苗場(chǎng)分別獲得6個(gè)不同時(shí)期的福建牡蠣幼體：擔(dān)輪幼體、D 形幼體、殼頂幼體、眼點(diǎn)幼體、附著變態(tài)幼體和稚貝，將幼體集中收集到培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中逐滴加入1 mol/L 的MgCl2溶液，并且不時(shí)的在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)幼體從浮游狀態(tài)到沉到底部且組織器官?zèng)]有活動(dòng)跡象時(shí)，將幼體收集到1.5 mL 的離心管中，將含有MgCl2的海水盡量吸取干凈，加入4%的多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA））。每個(gè)時(shí)期幼體取3組平行樣品。從廈門市第八市場(chǎng)獲取新鮮捕撈的福建牡蠣成體，解剖后獲得牡蠣7 種不同組織樣品，每個(gè)組織樣品獲取3個(gè)平行樣品。樣品加入TRIzol 試劑，依據(jù)TRIzol 試劑提取的方法提取不同樣品的總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），ND-1000 測(cè)定 RNA 的濃度。使用TaKaRa 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以1.5 μg 總RNA 作為反轉(zhuǎn)錄模板，制備不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）文庫，設(shè)計(jì) SMRP1 基因特異性引物（表1），以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10 倍為模板，18S 核糖體RNA為內(nèi)參基因，用ABI7500 熱循環(huán)儀檢測(cè)SMRP1 基因在福建牡蠣幼體不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)變化[4]。熒光定量的數(shù)據(jù)處理采用公式：N=2-ΔCt(Ct-18)（Ct 代表熒光定量熱循環(huán)儀所采集到循環(huán)數(shù)）。

不同發(fā)育階段的表達(dá)數(shù)據(jù)比較采用SPSS 軟件分析差異。

表1 引物序列Table 1 List of primers sequences

1.4 SMRP1基因在福建牡蠣鰓和外套膜中的表達(dá)定位分析

利用設(shè)計(jì)的SMRP1 基因特異性引物（表1），PCR擴(kuò)增獲得429 bp SMRP1 基因片段，將429 bp 的片段克隆到PGEM-T EASY 載體中，測(cè)序確定PGEM-T EASY 載體中SMRP1 基因拍片段的正確性，利用克隆好的PGEM-T EASY 載體為模板，擴(kuò)增獲得帶有T7 和SP6 啟動(dòng)子序列的DNA 片段。使用DIG-RNA labeling Kit 試劑盒獲得SMRP1 基因的特異原位雜交探針。

切片原位雜交：解剖新鮮采購的福建牡蠣成體，獲得鰓和外套膜組織，將組織樣品固定于4%的多聚甲醛溶液中，4 ℃固定過夜。磷酸緩沖液洗3 次，每次10 min，然后依次浸泡于25%、50%和75%乙醇溶液中各10 min。然后進(jìn)行樣品的透明和包埋。將包埋好的樣品用組織切片機(jī)切片，切片的厚度為5 μL，切片展片于多聚賴氨酸包埋好的載玻片上，42 ℃烘烤3 h。然后參考牡蠣性腺切片原味雜交的方法[5]，對(duì)牡蠣鰓和外套膜進(jìn)行表達(dá)定位試驗(yàn)。

紅琴笑靨如花，像盅惑人的林中女妖。她的身上散發(fā)出一種奇異的幽香，與林中的草木的氣息混合在一起，形成一種令人沉醉的芬芳。風(fēng)一吹，樹上有幾片黃葉飄落下來。你真的要離開我？她問。他沒有回答，以往總是她逃離茶莊，去山下的小村子。她做夢(mèng)也沒有想到，有朝一日他也會(huì)離開茶莊，離山下的紅塵世界越來越遠(yuǎn)，直至像一朵云一樣飄走。她害怕了，莫非他還要再次出家，重新皈依佛門，遁入空門去白云寺當(dāng)和尚？如果真是這樣，這一次他一定是看破了紅塵，一定會(huì)受戒的。她突然大聲尖叫起來，不，你不能走！我不讓你走！

1.5 SMRP1基因在牡蠣幼體發(fā)育過程中的組織定位分析

從育苗場(chǎng)分別獲得3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的牡蠣幼體：D 形幼體、殼頂幼體、和眼點(diǎn)幼體，取樣方法參照文章1.3 部分，幼體4 %的多聚甲醛固定之后，分別用25%、50%、75%和100%甲醇脫水，每次5 min。最終在100%的甲醇中-20 ℃保存待用。整體原位雜交參照在海鞘生物中的試驗(yàn)方法[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SMRP1基因在牡蠣幼體不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的表達(dá)分析

通過比對(duì)分析福建牡蠣幼體5個(gè)不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組文庫獲得SMRP1 基因序列。對(duì)獲得的SMRP1 的核酸和蛋白序列的分析如圖1所示，全長1 468 bp，編碼396 氨基酸。核酸序列含有一個(gè)起始密碼子和終止密碼子，且在序列后部含有一個(gè)加尾信號(hào)。

利用不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組文庫分析SMRP1 在幼體不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示，SMRP1 基因在牡蠣幼體的6個(gè)發(fā)育時(shí)期中眼點(diǎn)幼體、變態(tài)過程中和稚貝時(shí)期表達(dá)相對(duì)較高，尤其是在變態(tài)過程中表達(dá)最高。通過qRT-PCR 檢測(cè)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，SMRP1基因除了在變態(tài)前后時(shí)期和變態(tài)過程中表達(dá)很高之外，在殼頂?shù)某跗诒磉_(dá)量也相對(duì)會(huì)高些。

圖1 SMRP1基因的核酸和蛋白序列分析Fig.1 SMRP1 cDNA sequence and protein sequence analysis

圖2 SMRP1基因組在不同發(fā)育時(shí)期幼體表達(dá)Fig.2 SMRP1 gene expression pattern during different development stages

2.2 SMRP1基因組織特異性表達(dá)分析

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

圖3 SMRP1基因在不同組織器官的表達(dá)結(jié)果Fig.3 SMRP1 gene expression pattern from different tissues

由圖3可知，SMRP1 基因在牡蠣中具有明顯的組織特異性。SMRP1 基因在外套膜和鰓組織中表達(dá)量明顯高于其它組織，特別是在外套膜中的表達(dá)量尤其高。

2.3 SMRP1基因在鰓組織中的表達(dá)定位分析

利用組織原位雜交技術(shù)，獲得SMRP1 基因在福建牡蠣鰓組織中的表達(dá)定位結(jié)果如圖4所示。

圖4 SMRP1 mRNA在鰓組織中的空間表達(dá)分析Fig.4 SMRP1 mRNAspatialexpression analysis in gill tissue

SMRP1 基因主要在福建牡蠣鰓主鰓絲的普通鰓絲外表皮細(xì)胞中，還有表達(dá)在瓣間連接的一些外表皮細(xì)胞上。

2.4 SMRP1基因在外套膜組織中的表達(dá)定位分析

利用組織原位雜交技術(shù)，獲得SMRP1 基因在福建牡蠣外套膜組織中的表達(dá)定位結(jié)果如圖5所示，SMRP1 基因主要表達(dá)在牡蠣外套膜組織邊緣的外表皮細(xì)胞中。

圖5 SMRP1 mRNA在外套膜組織中的空間表達(dá)分析Fig.5 SMRP1 mRNA spatial expression analysis in mantle tissue

2.5 SMRP1基因在幼體不同發(fā)育時(shí)期的組織定位分析

利用整體原位雜交技術(shù)，獲得SMRP1 基因在牡蠣不同發(fā)育時(shí)期幼體中的表達(dá)分析結(jié)果如圖6所示。

圖6 SMRP1 mRNA在不同發(fā)育時(shí)期幼體空間表達(dá)分析Fig.6 SMRP1 mRNA spatial expression analysis in different development stages

SMRP1 基因從牡蠣殼頂幼體初期開始大量表達(dá)，且可以觀察到SMRP1 基因在殼頂時(shí)期集中表達(dá)在身體中部偏殼開口的位置。幼體發(fā)育到眼點(diǎn)時(shí)期可以明顯的觀察到SMRP1 基因大量集中表達(dá)在外套膜的邊緣位置。

3 討論與結(jié)論

福建牡蠣是我國重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類，特別是在福建沿海地帶，是牡蠣的主要養(yǎng)殖貝類，福建牡蠣是典型的濾食性動(dòng)物，濾食性貝類鰓的作用非常重要，具有呼吸和攝食的雙重作用[7]，海水被牡蠣吸入體內(nèi)后，流經(jīng)鰓組織，鰓絲上的纖毛一方面有過濾食物的作用，通過纖毛的運(yùn)動(dòng)將食物運(yùn)到口處，另一方面的功能可以進(jìn)行氣體交換。所以鰓的生長與發(fā)育直接影響到牡蠣的生長發(fā)育。

通過對(duì)福建牡蠣幼體不同發(fā)育轉(zhuǎn)錄組庫分析發(fā)現(xiàn)幼體附著變態(tài)時(shí)期高表達(dá)基因SMRP1，SMRP1 主要分布在牡蠣鰓的主鰓絲和普通鰓絲的上皮細(xì)胞里，這些柱狀的上皮細(xì)胞具有非常重要的作用，他們通過控制自身上的纖毛來控制對(duì)食物的運(yùn)送。SMRP1 基因還有一個(gè)主要分布區(qū)就是在瓣間連接上的扁平細(xì)胞里，瓣間連接是由2 排單層扁平細(xì)胞及其腔隙構(gòu)成，腔隙內(nèi)為含血腔的結(jié)締組織。瓣間連接的扁平細(xì)胞區(qū)是牡蠣的呼吸上皮區(qū)[8-9]，是鰓絲與外界進(jìn)行氣體交換的部位。由此可見SMRP1 基因的主要表達(dá)在鰓組織的2 大功能區(qū)域。SMRP1 基因的功能是與生長發(fā)育密切相關(guān)的，可見SMRP1 基因?qū)Ω＝迪狏w組織的生長和發(fā)育起著重要的作用，進(jìn)而直接影響牡蠣進(jìn)食和呼吸。

貝類外套膜組織形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)方面的研究已經(jīng)很多[10-11]，牡蠣的外套膜有左右2 片，每片由外側(cè)上皮細(xì)胞、內(nèi)側(cè)上皮細(xì)胞和中央的結(jié)締組織組成，外套膜的邊緣分成3 部分，外層、中層和內(nèi)層，外層稱為生殼突起，主要功能是分泌貝殼，中層稱為感覺突起對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，專司感覺作用；內(nèi)層稱為緣膜突起可以伸展和收縮，控制進(jìn)水孔的通道，具調(diào)節(jié)水流的作用。外層殼側(cè)的表皮細(xì)胞中含有大量的嗜堿性粒，推測(cè)是堿性磷酸酶的酶原粒，該酶是碳酸鈣結(jié)晶的關(guān)鍵酶[12-13]，所以外套膜殼側(cè)的表皮細(xì)胞對(duì)貝殼的生長具有重要的作用。而中層的感覺作用主要也是通過其突起的表皮細(xì)胞來完成的。跟生長密切相關(guān)的SMRP1 基因集中分布在外套膜的表皮細(xì)胞中，對(duì)外套膜表皮細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)具有非常重要的作用。

綜上所述，SMRP1 基因主要表達(dá)在外套膜和鰓的關(guān)鍵功能區(qū)域的表皮細(xì)胞中，對(duì)外套膜和鰓的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，從而直接影響了其組織功能的發(fā)揮。