鄭麗雪，黎英，王家皓，董苗苗，陳倩倩，齊斌，*

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇 常熟 215500）

長久以來，抑菌防腐一直是食品工業(yè)的研究重點，而山梨酸鉀、苯甲酸鈉等化學合成防腐劑因抑菌效果好且價格低廉而被廣泛應用[1-4]。伴隨著經(jīng)濟發(fā)展、時代進步，人們對生活質量的要求也逐步提高，更加關注衣食住行的品質，這對食品營養(yǎng)和健康提出了新的要求。傳統(tǒng)食品防腐劑如苯甲酸鈉等，多來源于化學合成，盡管價格低廉，但大劑量應用仍存在安全風險[5]。因此，高效、低毒防腐劑的開發(fā)依舊是食品科學研究的熱點問題，而天然防腐劑具備這一特性，也能滿足人們對高品質食品的需求。

微生物、植物產(chǎn)生的天然防腐劑廣泛應用于食品、化妝品行業(yè)[6-12]。丙酸桿菌代謝物近年作為新型食品防腐劑也越來越得到國內學者的重視和青睞。丙酸桿菌代謝物是由乳品丙酸桿菌合成的細菌素，細菌素主要是多肽或蛋白質，其可通過多種機制抑制腐敗菌[13-15]，已有研究表明，丙酸桿菌的代謝物質對食品的防腐也有一定的作用。賈彩鳳[15]發(fā)現(xiàn)丙酸桿菌代謝物對惡臭假單胞菌具有抑制作用，并發(fā)現(xiàn)：5%的接種量，30 ℃培養(yǎng)72 h，丙酸桿菌代謝物抑菌活性較高。陳玉梅[16]比較了乳酸鈉（sodium lactate broth，SLB）SLB、葡萄糖和脫脂乳3 種培養(yǎng)基對其丙酸桿菌代謝物抑菌作用的影響，發(fā)現(xiàn)：1%接種量的丙酸桿菌在葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)到第8天時的抑菌活性最高。王海晶[17]研究了丙酸桿菌代謝物的抑菌作用，并對高產(chǎn)菌株發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)：丙酸桿菌代謝物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為19.8 mm；葡萄糖、Tween 80、pH 值是影響抑菌活性的關鍵發(fā)酵參數(shù)。鑒與此，本文以費氏丙酸桿菌素為研究對象，以大腸桿菌和沙門氏菌為其指示菌，通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基、接種量和初始培養(yǎng)pH 值3 方面，研究其代謝產(chǎn)物丙酸桿菌素對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用，并與山梨酸鉀的抑菌作用進行對比，旨在為以后天然防腐劑的深入研究提供理論參考[18]。

1 材料與方法

1.1 材料

費氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii CS1420，P.freudenreichii CS1420）、大腸桿菌、沙門氏菌：均為常熟理工學院生物與食品工程學院發(fā)酵工程中心保存。

山梨酸鉀（純度＞99.0%）、氯化鈉（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；乳酸鈉（純度98%）、葡萄糖（分析純）、十二水合磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（純度99.8%）：阿拉丁上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰酶水解酪素、酵母提取物、LB 液體培養(yǎng)基、7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-100A 型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DHP-9162303A-5S 型電熱恒溫培養(yǎng)箱；FA604A 型精密電子天平：上海精天電子儀器有限公司；UV-2450 型紫外-可見分光光度計：日本島津公司；PE20 型實驗室pH 計：梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；Milli-Q Advantage 超純水儀：美國Millipore 公司；SW-CJ-1B 超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；CR22GⅡ型高速冷凍離心機：日本日立公司；Bio-Rad x Mark 酶標儀：美國 Bio-Rad 公司；HP100 抽氣型厭氧罐：常州諾基儀器有限公司；BLBIO-5SJ-10SJ-A 發(fā)酵罐：連云港百侖生物；MHY-27766 二氧化碳發(fā)生器：北京美華儀科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 丙酸桿菌培養(yǎng)基

1）乳酸鈉培養(yǎng)基

胰酶水解酪素10 g，酵母提取物5 g，乳酸鈉10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

2）葡萄糖培養(yǎng)基

用2%的葡萄糖代替乳酸鈉培養(yǎng)基中的乳酸鈉，其他成分不變，pH 7.0～7.2。

3）脫脂乳粉培養(yǎng)基

脫脂奶粉20g，酵母粉1g，蒸餾水1000mL，pH5.3。

1.3.2 大腸桿菌培養(yǎng)基[5]

酵母膏5 g，蛋白胨10 g，瓊脂1 %～2 %，氯化鈉10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。

1.3.3 沙門氏菌培養(yǎng)基

蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉（含12個結晶冰）9 g，磷酸二氫鉀 1.5 g，蒸餾水 1 000 mL，靜置10 min，煮沸溶解，調整 pH（7.0±0.2）。

1.3.4 0.1%的山梨酸鉀溶液

稱取0.1 g 的山梨酸鉀溶解于滅好菌的100 mL 的乳酸鈉培養(yǎng)基混合均勻。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將斜面保存的費氏丙酸桿菌菌株劃線接種于乳酸鈉固體培養(yǎng)基上，于30 ℃厭氧罐中厭氧培養(yǎng)2.5 d。

將斜面保存好的大腸桿菌ATCC25922、沙門氏菌分別接種于LB 液體培養(yǎng)基、7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng) 12 h。

1.4.2 抑菌活性測定

采用酶標法測定代謝物的抑菌活性[13]。將離心后所得上清液用SLB 培養(yǎng)基溶液進行2N梯度稀釋，然后將不同稀釋倍數(shù)的稀釋液分別加入96 孔酶標板中，每個孔的體積為200 μL，其中100 μL 為不同稀釋倍數(shù)的抑菌物質，100 μL 為指示菌培養(yǎng)液，并以 100 μL 的SLB 培養(yǎng)基和100 μL 的指示菌培養(yǎng)液作為對照，制得酶標板后將其置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。用酶標儀測定每孔在600 nm 處吸光值。當測定的OD 值為對照組的一半，則代謝產(chǎn)物的稀釋度為一個抑菌活力單位，單位為 AU/mL[19]。

1.4.3 時間對丙酸桿菌抑菌活性影響

將培養(yǎng)好的種子液接入裝有乳酸鈉培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃，厭氧培養(yǎng)2.5 d。將擴大培養(yǎng)好的種子液按10%接種量接種至5 L 發(fā)酵罐中，30 ℃，100 r/min，發(fā)酵期間通入CO2使罐壓保持0.05 MPa，控制pH 值為6.0，連續(xù)培養(yǎng)8 d，期間每天取樣測量菌體干重及發(fā)酵液抑菌活性[20]。以此考察丙酸桿菌抑菌活性隨時間變化，得到丙酸桿菌抑菌活性最佳培養(yǎng)時間。

1.4.4 3 種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物與山梨酸鉀抑菌作用比較

將活化好的P.freudenreichii CS1420 分別接種于葡萄糖培養(yǎng)基、SLB 培養(yǎng)基和脫脂乳培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)時間根據(jù)1.4.3 試驗結果確定，得到丙酸桿菌代謝物后在5 000 r/min 條件下離心15 min，取其上清液采用“2 倍系列稀釋法”[21]稀釋處理，直至稀釋度為2-8截止。后制其酶標板并且每個稀釋度做3個平行。對其抑菌活性進行測定，以考察不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌情況，并與山梨酸鉀抑菌作用比較分析。

1.4.5 不同接種量培養(yǎng)的得到的丙酸桿菌代謝物與山梨酸鉀抑菌作用比較

將丙酸桿菌種子液以4%、5%、6%、7%、8 %的接種量分別接入1.4.4 試驗所得的丙酸桿菌最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間根據(jù)1.4.3 試驗結果確定。抑菌活性測定方法同上，以考察不同接種量培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌活性，并與山梨酸鉀抑菌作用比較分析。

1.4.6 不同初始pH 值培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物與山梨酸鉀抑菌作用比較

將丙酸桿菌培養(yǎng)基初始pH 值分別設定為5、5.5、6、6.5、7，5個梯度分別進行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基的類型和接種量的多少根據(jù)1.4.3、1.4.4、1.4.5 的結果依次確定，抑菌活力測定方法同上。以考察在不同初始pH 值培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌活性，并與山梨酸鉀抑菌作用比較分析。

2 結果與討論

2.1 丙酸桿菌抑菌活性隨時間變化曲線

發(fā)酵時間對丙酸桿菌抑菌活性的影響如圖1所示。

圖1 丙酸桿菌抑菌活性隨時間變化曲線Fig.1 Curve of antibacterial activity of Propionibacterium with time

由圖1可知，P.freudenreichii CS01 在生長 24 h 后進入對數(shù)生長期，抑菌活力值呈現(xiàn)幾何級數(shù)增大，在72 h 后抑菌活性值變得緩慢，直到96 h 進入穩(wěn)定期，192 h 后抑菌活力值最大。試驗選擇的培養(yǎng)時間應選擇其菌體穩(wěn)定期，生長量大，酶系活躍，抑菌活力最佳且代謝旺盛的菌體[22]，因此選取培養(yǎng)時間為192 h 的發(fā)酵液進行抑菌作用的比較試驗。

2.2 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌和沙門氏菌抑菌作用與山梨酸鉀的比較

通過酶標法所測定不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物，對大腸桿菌和沙門氏菌抑菌活性與山梨酸鉀的抑菌情況進行對比分析。結果如圖2、圖3所示。

圖2 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌的抑菌活性Fig.2 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different culture media on E.coli

圖3 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對沙門氏菌的抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different media cultures against Salmonella

由圖2、圖3可以看出，試驗所選擇的3 種丙酸桿菌培養(yǎng)基（葡萄糖、SLB、脫脂乳）均對大腸桿菌和沙門氏菌有一定的抑制作用，當在SLB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)后所得到的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌活性均能達到最佳，分別為25.3 AU/mL 和18.3 AU/mL，其抑菌效果優(yōu)于相同條件下的山梨酸鉀。但是在脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)后所得到的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌活性的效果卻不如傳統(tǒng)防腐劑山梨酸鉀。

在脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)后所得到的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果不及在SLB、葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)后所得到的丙酸桿菌代謝物和傳統(tǒng)防腐劑山梨酸鉀對指示菌的抑制效果，抑菌活性分別為13.6 AU/mL 和10.9 AU/mL。其可能原因是由于脫脂乳培養(yǎng)基本身的初始pH 值就比較低，再加上丙酸桿菌在生長過程中也會產(chǎn)生丙酸、乙酸等有機酸[23]，致使丙酸桿菌在脫脂乳培養(yǎng)基上生長速度較為緩慢，代謝產(chǎn)物生產(chǎn)量少，故相較其他兩種培養(yǎng)基所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對指示菌的抑制效果也不太理想。

因此，從數(shù)據(jù)分析比較來看，實際生產(chǎn)中可選擇SLB 培養(yǎng)基或者葡萄糖培養(yǎng)基對丙酸桿菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，所得其代謝產(chǎn)物丙酸桿菌素對大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果要優(yōu)于0.1%的山梨酸鉀。

2.3 不同接種量培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌和沙門氏菌抑菌作用與山梨酸鉀的比較

通過酶標法所測定不同接種量培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物，對大腸桿菌和沙門氏菌抑菌活性與山梨酸鉀的抑菌情況進行對比分析。結果如圖4、圖5所示。

圖4 不同接種量培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different inoculum cultures against E.coli

圖5 不同接種量培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對沙門氏菌的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different inoculum cultures against Salmonella

由圖4、5 可以看出，接種量的多少對丙酸桿菌發(fā)酵所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果還是有一定的影響。比較之下接種量為5%培養(yǎng)發(fā)酵后所得的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌活性均能達到最佳，分別為28.8 AU/mL 和18.1 AU/mL，其抑菌效果優(yōu)于相同條件下的山梨酸鉀。但是通過增大其接種量，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對大腸桿菌和沙門氏菌抑菌活性呈下降趨勢，當接種量為8%時其抑菌活性分別僅為16.2 AU/mL 和10.5 AU/mL，比較于山梨酸鉀的21.1 AU/mL 和14.0 AU/mL，其抑菌效果要差于山梨酸鉀對大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果。其原因可能是因為雖然增大其接種量可以縮短延滯期，加快菌體的生成，使得產(chǎn)物形成期得以提前；但是也并非接種量越大越好，接種量的過大會導致其菌體生長速度過于快速，也較早的消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，使得培養(yǎng)后期菌體得不到充足的營養(yǎng)而造成培養(yǎng)基粘度增大等一系列不良變化[2]。

因此生產(chǎn)中應選用接種量為5%或6%時其抑菌效果要優(yōu)于0.1%的山梨酸鉀，更能達到對大腸桿菌和沙門氏菌抑制效果。

2.4 不同初始培養(yǎng)pH值培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌和沙門氏菌抑菌作用與山梨酸鉀的比較

不同初始培養(yǎng)pH 值培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌和沙門氏菌抑菌作用與山梨酸鉀的比較，結果見圖6、圖7。

圖6 不同初始pH值培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌的抑菌活性Fig.6 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites cultured at different initial pH values against E.coli

圖7 不同初始pH值培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對沙門氏菌的抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different initial pH values on Salmonella

由圖6、圖7可以看出，初始pH 值的不同對沙門氏菌的抑菌效果差距較為明顯，而對大腸桿菌的抑制效果差距相差不大。對于大腸桿菌來說，在pH 值為5.5、6、6.5 時其抑菌活性分別為 27.5、26.1 AU/mL 和26.9 AU/mL。由此可見pH 值為5.5～6.5 之間，比于0.1%的山梨酸鉀抑菌活性值為21.1 AU/mL，丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌抑菌效果優(yōu)于山梨酸鉀。生產(chǎn)中選用初始pH 值為6.5 時能達到較好的抑菌效果。

當選擇初始pH 值為5 時，培養(yǎng)后的丙酸桿菌代謝物無法利用酶標法計算其對沙門氏菌的抑菌活性，在 pH 值為 5.5、6、6.5、7 時其抑菌活性分別為 12.1、14.5、7.9 AU/mL 和 14.1 AU/mL。由此可見 pH 值為 6時，丙酸桿菌代謝物對沙門氏菌有很好的抑菌效果。相比于山梨酸鉀抑菌活性值為14.1 AU/mL，0.1%的山梨酸鉀抑菌效果與丙酸桿菌素對沙門氏菌的抑制效果相差不大。

3 結論

改變丙酸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基、初始培養(yǎng)pH 值、接種量3個方面進行研究，再與0.1%的山梨酸鉀抑菌作用進行一定的比較分析后：

1）從費氏丙酸桿菌生長抑菌活性隨時間變化試驗可知，在第192 h 抑菌值最佳。因此選取培養(yǎng)時間為第192 h 的發(fā)酵液進行抑菌作用的比較試驗。

2）從選擇的葡萄糖、SLB、脫脂乳3 種丙酸桿菌培養(yǎng)基來看，在SLB 培養(yǎng)基發(fā)酵得到的丙酸桿菌素均對大腸桿菌和沙門氏菌抑菌活力達到最佳值分別為25.3 AU/mL 和18.3 AU/mL，相比較的山梨酸鉀的抑菌活性為21.1、14.1 AU/mL，可見其抑菌活性較優(yōu)于傳統(tǒng)的山梨酸鉀，但是丙酸桿菌在脫脂乳培養(yǎng)基上后所得到丙酸桿菌素的抑制效果卻不及傳統(tǒng)的山梨酸鉀。

3）對于接種量而言，選擇SLB 培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)后，結果表明丙酸桿菌代謝物接種量為5%或6%時其大腸桿菌抑菌活力值均能達到28.1 AU/mL，其抑菌效果要優(yōu)于傳統(tǒng)的山梨酸鉀。對于沙門氏菌而言，接種量為5%時沙門氏菌抑菌活力值達到18.0 AU/mL，其抑菌效果會優(yōu)于傳統(tǒng)的山梨酸鉀；對于接種量為8%時對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果要不及山梨酸鉀。

4）對于不同初始pH 值而言，同樣選擇SLB 作為其發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為5%后，結果表明丙酸桿菌代謝物初始培養(yǎng)pH 值為6.5 時其抑菌活性對大腸桿菌所產(chǎn)生抑菌效果最佳值為26.9 AU/mL，初始培養(yǎng)pH值為6 時其抑菌活性對沙門氏菌所產(chǎn)生抑菌效果最佳值為14.5 AU/mL。與0.1%的山梨酸鉀的抑菌效果相比較而言，其對沙門氏菌的抑菌效果與丙酸桿菌代謝物抑菌效果相當，生產(chǎn)中選用初始pH 值為6 時也能達到較好的抑制效果。