龔倩倩,陳鐵江

龔倩倩,陳鐵江,義烏市中心醫(yī)院急診科 浙江省義烏市 322000

核心提要：miR-181a-5p在胰腺炎中發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制與靶向抑制下游的促炎因子白血病抑制因子的表達(dá)密切相關(guān).

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是胰腺內(nèi)胰酶過(guò)度激活導(dǎo)致胰腺組織自身消化、出血、壞死的炎性疾病,易發(fā)生全身炎性反應(yīng)綜合征,死亡率高達(dá)約30%[1,2].由于現(xiàn)代人生活不規(guī)律(暴飲暴食、酗酒),導(dǎo)致AP的發(fā)病率逐年上升[3].即使患者脫離生命危險(xiǎn),長(zhǎng)期的藥物治療也會(huì)對(duì)胰腺造成損傷[4].miRNA為長(zhǎng)度在19-23個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性短鏈非編碼微小的RNA分子,其參與人類(lèi)多種疾病的發(fā)生發(fā)展[5].白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)是白介素-6(interleukin-6,IL-6)家族中的一個(gè)多功能細(xì)胞因子,其作為促炎癥細(xì)胞因子參與了多種炎癥反應(yīng),但其胰腺炎癥作為抗炎因子發(fā)揮作用[6,7].miR-181a-5p與LIF在胰腺炎中的作用及機(jī)制尚未十分清楚.本研究擬以大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J為研究對(duì)象,用雨蛙素誘導(dǎo)AR42J損傷建立胰腺炎細(xì)胞模型,檢測(cè)雨蛙素誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞中miR-181a-5p、LIF的表達(dá),觀察過(guò)表達(dá)miR-181a-5p、敲減LIF對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞凋亡的影響,揭示其機(jī)制可能與miR-181a-5p靶向LIF有關(guān),將為AP的靶向治療提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J購(gòu)自美國(guó)ATCC;雨蛙素購(gòu)自美國(guó)sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Sellect公司;LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連Takara公司;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)檢測(cè)試劑盒、IL-6檢測(cè)試劑盒、淀粉酶(AMY)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自江蘇江萊生物;PVDF膜購(gòu)自德國(guó)羅氏公司;SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購(gòu)自碧云天公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,置于37 ℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度75%左右,用胰蛋白酶消化約1 min,按照1：3的比例更換培養(yǎng)基,每2 d傳代一次.

1.2.2 AP細(xì)胞模型制造及分組：雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞AP模型：將AR42J細(xì)胞調(diào)整至5×104個(gè)/mL,接種于6孔板,培養(yǎng)24 h后,然后用15 nmol/L雨蛙素處理0、4、8、12、16 h,用于后續(xù)篩選最佳處理時(shí)間,并將最佳處理時(shí)間下的AR42J細(xì)胞標(biāo)記為Cerulein組.將anti-miR-con、anti-miR-181a-5p、si-con、si-LIF按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)要求轉(zhuǎn)染至Cerulein組AR42J細(xì)胞,轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h,再用15 nmol/L雨蛙素處理8 h,標(biāo)記為Cerulein+antimiR-con組、Cerulein+anti-miR-181a-5p組、Cerulein+sicon組、Cerulein+si-LIF組,用于后續(xù)試驗(yàn).

1.2.3 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AMY、TNF-α和IL-6的表達(dá)：按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作檢測(cè)1.2.2各組AR42J細(xì)胞中AMY、TNF-α和IL-6的表達(dá).

1.2.4 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將1.2.2各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞,用結(jié)合緩沖液 500 μL 懸浮細(xì)胞,分別加入5 μL的 Annexin V-/FITC和PI,混勻,室溫避光靜置15 min.采用流式細(xì)胞儀分析測(cè)定結(jié)果.細(xì)胞的凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率.每個(gè)樣品重復(fù)3次.

1.2.5 Western blot檢測(cè)LIF、caspase-3的蛋白表達(dá)：收集1.2.2各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞,加入裂解液,冰上裂解35 min.12000 rpm離心10 min,取上清置于EP管,加入5×SDS上樣緩沖液,沸水煮沸10 min.電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜;5%脫脂奶粉將膜封閉2 h,洗膜,加入Ⅰ抗,4 ℃過(guò)夜孵育,洗膜,加Ⅱ抗,4 ℃ 2 h.加發(fā)光液,曝光.

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：將構(gòu)建的BDNF 3'UTR-WT(含LIF 3'UTR片段)和LIF 3'UTR-MUT(含LIF 3'UTR片段突變體)的熒光素酶報(bào)告載體,采用LipofectamineTM2000分別將LIF 3'UTR-WT和LIF 3'UTRMUT與miR-181a-5p mimics、miR-con共轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h,按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒技術(shù)手冊(cè)操作,記錄螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶激發(fā)值,以?xún)烧叩谋戎翟u(píng)價(jià)LIF基因的激活程度.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析.計(jì)量資料用mean±SD表示,多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞對(duì)AMY、TNF-α和IL-6表達(dá)及凋亡的影響 結(jié)果如圖1所示,Cerulein組AR42J細(xì)胞在處理8 h時(shí)AMY、TNF-α和IL-6的表達(dá)均升高(圖1A);與Control組相比,Cerulein組AR42J細(xì)胞的凋亡率顯著升高(圖2B和C,P＜0.05).

2.2 雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞miR-181a-5p低表達(dá)和LIF高表達(dá) 結(jié)果如圖2所示,與Control組相比,Cerulein組AR42J細(xì)胞miR-181a-5p表達(dá)顯著下降(圖2A),LIF mRNA(圖2B)和蛋白表達(dá)(圖2C和D)均顯著升高(P＜0.05).

2.3 過(guò)表達(dá)miR-181a-5p抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞的凋亡 結(jié)果如圖3所示,與Cerulein+miR-con組相比,Cerulein+miR-181a-5p組AR42J細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)顯著升高(圖3A),細(xì)胞凋亡率顯著降低(圖3B,P＜0.05).

2.4 過(guò)表達(dá)miR-181a-5p對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中caspase-3蛋白的表達(dá) 結(jié)果如圖4所示,與Cerulein+miR-con組相比,Cerulein+miR-181a-5p組AR42J細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(圖4A和B,P＜0.05).

2.5 miR-181a-5p靶向LIF 運(yùn)用miRcode數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-181a-5p與LIF 3'UTR存在結(jié)合位點(diǎn)(圖5A);雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示,與miR-con組相比,miR-181a-5p組WT-LIF細(xì)胞中熒光活性顯著降低,MUT-LIF細(xì)胞中熒光活性不受影響(圖5B);與miR-con組相比,miR-181a-5p組細(xì)胞中LIF表達(dá)顯著降低,與anti-miR-con組相比,antimiR-181a-5p組細(xì)胞中LIF表達(dá)顯著升高(圖5C,P＜0.05).

2.6 敲減LIF抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞的凋亡 結(jié)果如圖6所示,與Cerulein+si-con組相比,Cerulein+si-LIF組AR42J細(xì)胞中LIF蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(圖6A),細(xì)胞的凋亡率顯著降低(圖6B和C,P＜0.05).

圖2 雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞miR-181a-5p低表達(dá)和LIF高表達(dá).A：雨蛙素對(duì)AR42J細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)的影響;B：雨蛙素對(duì)AR42J細(xì)胞中LIF mRNA表達(dá)的影響;C、D：雨蛙素對(duì)AR42J細(xì)胞中LIF 蛋白表達(dá)的影響.aP＜0.05,與對(duì)照組相比.

圖3 過(guò)表達(dá)miR-181a-5p抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞的凋亡.A：過(guò)表達(dá)miR-181a-5p對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)的影響;B：過(guò)表達(dá)miR-181a-5p對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡的影響;C：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡.aP＜0.05,與對(duì)照組相比.

圖4 抑制miR-181a-5p抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中caspase-3蛋白的表達(dá).A：抑制miR-181a-5p對(duì)caspase-3蛋白表達(dá)的影響;B：抑制miR-181a-5p對(duì)caspase-3蛋白表達(dá)量的影響.aP＜0.05,與對(duì)照組相比.

圖5 miR-22靶向LIF.A：為互補(bǔ)序列;B：miR-181a-5p對(duì)AR42J細(xì)胞熒光活性的影響;C：miR-181a-5p對(duì)AR42J細(xì)胞中LIF蛋白表達(dá)的影響.aP＜0.05,與miR-con組相比較;cP＜0.05,與anti-miR-con組相比較.

3 討論

miRNA為1993年首次在秀麗線(xiàn)蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的一種22 nt的長(zhǎng)鏈非編碼小分子RNA[8].miRNA參與構(gòu)成機(jī)體約3%的基因組,30%-90%的人類(lèi)基因由miRNA調(diào)控,且一個(gè)miRNA可調(diào)控?cái)?shù)千個(gè)目標(biāo)基因[9].近年來(lái),miRNA在視網(wǎng)膜疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、癌癥等多種人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用被廣泛研究.如miR-551b-5p、miR-92b、miR-10a、miR-7在胰腺炎均出現(xiàn)異常表達(dá),其中miR-551b-5p可通過(guò)正向調(diào)控組ICC內(nèi)鈣離子濃度發(fā)揮調(diào)控胰腺炎進(jìn)展的作用[10].林金歡[11]、傅冬陽(yáng)等[12]在胰腺炎的研究中均報(bào)道,miRNA在胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,推測(cè)其機(jī)制可能與miRNA與mRNA之間復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相關(guān).姚汝鋮等[13]研究發(fā)現(xiàn),miR-181a可用來(lái)鑒別診斷胰腺癌、慢性胰腺炎、正常胰腺及胰腺的內(nèi)分泌腫瘤.An等[14]在AP的研究中通過(guò)微陣列分析胰腺炎患者血清miRNA的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p的表達(dá)不斷下調(diào),并運(yùn)用miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)揭示了miR-181a-5p的下調(diào)與甘油三酯,總膽固醇和快速血糖具有良好的負(fù)相關(guān)性,與Ca2+呈正相關(guān),提示miR-181a-5p可作為診斷AP的生物標(biāo)志物.本研究運(yùn)用qRT-PCR法檢測(cè)了雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中miR-181a-5p的表達(dá)發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p低表達(dá),這與An的研究結(jié)果相一致;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-181a-5p可抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用;深入研究運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,miR-181a-5p可靶向負(fù)調(diào)控LIF表達(dá).

圖6 敲減LIF抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞的凋亡.A：敲減LIF對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中LIF表達(dá)的影響;B：敲減LIF對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡的影響;C：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況.aP＜0.05,與對(duì)照組相比.

TNF-α、IL-1、IL-6是胰腺炎的主要致炎因子[15],其中TNF發(fā)生在炎癥起始階段,誘導(dǎo)IL-1、IL-6引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[16],但有研究報(bào)道,炎性因子水平的變化與胰腺炎的病理進(jìn)程并不相一致[17].LIF屬于IL-6家族成員,為多功能細(xì)胞因子,其在正常組織或血液中低表達(dá),炎性介質(zhì)可誘導(dǎo)其表達(dá),抗炎物質(zhì)可抑制其表達(dá)[18].滕曉麗等[19]通過(guò)?；悄懰徕c建立大鼠SAP模型,運(yùn)用RT-PCR和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)模型大鼠肺組織中LIF的表達(dá)顯示,LIF的表達(dá)在SAP大鼠中顯著升高,提示LIF在SAP肺損傷中發(fā)揮促炎作用.吳鑫等[20]報(bào)道,LIF在AP晚期發(fā)揮促炎作用.孫濤[21]在AP的研究中發(fā)現(xiàn),miR-494在損傷胰腺腺泡細(xì)胞中高表達(dá),發(fā)揮抑制胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的作用,且可通過(guò)直接抑制LIF的表達(dá)抑制雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡,提示LIF在急性胰腺腺細(xì)胞中發(fā)揮損傷作用.本研究運(yùn)用qRT-PCR、Western blot檢測(cè)了雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J中LIF的表達(dá)發(fā)現(xiàn),LIF表達(dá)異常升高;深入研究發(fā)現(xiàn),敲減LIF可抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡.

總之,miR-181a-5p可抑制雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與靶向LIF有關(guān),為AP的治療研究奠定基礎(chǔ).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

miRNA在急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)中的作用已得到認(rèn)可,其中miR-181a-5p在AP中的研究甚少,且miR-181a-5p在AP中的作用機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚未有人研究.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本研究旨在研究miR-181a-5p在氫化可的松誘導(dǎo)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞損傷的凋亡情況,以期望為及時(shí)高效治療AP提供線(xiàn)索.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探討miR-181a-5p調(diào)控氫化可的松誘導(dǎo)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的作用,及這種作用的機(jī)制,以期為AP的治療提供新方向.

實(shí)驗(yàn)方法

用15 nmol/L雨蛙素處理大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J 8 h,運(yùn)用ELISA法檢測(cè)AMY、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)的表達(dá),分成Cerulein+anti-miR-con組、Cerulein+anti-miR-181a-5p組、Cerulein+si-con組、Cerulein+si-LIF組,用流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR、Western blot檢測(cè)細(xì)胞的凋亡、miR-181a-5p mRNA和LIF mRNA及LIF、caspase-3蛋白的表達(dá),雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-181a-5p靶向LIF.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究成功構(gòu)建雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J損傷,其中miR-181a-5p表達(dá)下調(diào),LIF表達(dá)上調(diào),細(xì)胞凋亡率上調(diào),且過(guò)表達(dá)miR-181a-5p或敲減LIF均可下調(diào)細(xì)胞的凋亡率,另外,miR-181a-5p靶向調(diào)控LIF.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

miR-181a-5p可抑制氫化可的松誘導(dǎo)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡,其可能與靶向LIF有關(guān),提示miR-181a-5p可作為AP治療的潛在作用靶點(diǎn).

展望前景

本研究?jī)H在體外研究miR-181a-5p對(duì)大鼠胰腺細(xì)胞損傷的凋亡影響,后期還需增加miR-181a-5p在胰腺炎大鼠體內(nèi)是否具有治療作用,以更清晰的展示miR-181a-5p對(duì)AP的治療價(jià)值,也為miR-181a-5p的靶向治療提供更加充分的依據(jù).