潘錦梅 梁西嵐 黎洛冰 劉沃滿 陳小樂

熒光定量PCR(quantitative fluorescent polymerase chain reaction)是目前臨床應(yīng)用較多的一種產(chǎn)前染色體異常的篩查和診斷方法, 能快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化的進(jìn)行唐氏綜合征及其他染色體非整倍體檢測［1］。本院2016 年3 月～2018 年3 月共對1940 例病例樣本行21、18、13、X 及Y 染色體非整倍體的QF-PCR 技術(shù)診斷, 并將診斷結(jié)果與核型分析結(jié)果進(jìn)行比較?？疾霶F-PCR 技術(shù)診斷常見染色體非整倍體疾病的敏感性和特異性, 評(píng)價(jià)其在染色體非整倍體疾病快速產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2016年3月~2018年3月1940例產(chǎn)前診斷病例樣本作為研究對象。

1.2 方法 采用QF-PCR 技術(shù)對樣本行21、18、13、X及Y染色體非整倍體診斷。

1.2.1 樣本 DNA的提取 所有孕婦在17 周后行羊水穿刺,采用美國伯樂公司的生產(chǎn)的BIO- RAD Chelex-100 Resin 抽提試劑盒獲取樣本DNA。

1.2.2 引物合成 從NCBI 數(shù)據(jù)庫中查取引物序列, 利用Primer 3.0 設(shè)計(jì)PCR 引物序列, 對檢測位點(diǎn)正向引物的“5”端進(jìn)行FAM(藍(lán)色)或HEX(綠色)熒光標(biāo)記。各染色體的STR 位點(diǎn)見表1。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系包括Takara 2×PCR 反應(yīng)預(yù)混液 12.5 μl, 引物混合液7.5 μl, 模板 DNA 50～100 ng。反應(yīng)條件為DNA 樣本95℃預(yù)變性5 min, 94℃ 變性30 s, 60℃保溫30 s, 72℃延伸1 min, 30 個(gè)循環(huán), 72℃延伸7 min, 4℃條件下保存。

1.2.4 凝膠電泳 取1 μl 的PCR 產(chǎn)物, 與9 μl 上樣液(包括8.7 μl 甲酰胺+0.3 μl 分子內(nèi)標(biāo))混合, 95℃變性5 min 后0℃冷卻5 min, 進(jìn)行凝膠電泳30 min。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 QF-PCR的檢測結(jié)果 采用GeneScan3.7軟件進(jìn)行分析處理, STR位點(diǎn)上等位基因擴(kuò)增后顯示為3個(gè)峰值面積比接近于1∶1∶1的熒光峰, 可直接判斷為三體型；若顯示為2個(gè)峰, 且雙峰面積比值>1.8或者<0.65可判定為三體；雙峰面積比值區(qū)間0.8~1.4則需重新檢測［2,3］。

1.3.2 染色體核型分析 按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)和G顯帶制片,參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN 2009)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析。各染色體的STR位點(diǎn)見表1。

表1 各染色體的STR位點(diǎn)

2 結(jié)果

1940 例羊水QF-PCR 檢測結(jié)果均在3 d 內(nèi)得出, 共有5 例染色體核型培養(yǎng)失敗, 檢出97 例(5.00%)異常病例, 包括21 三體綜合征62 例、18 三體綜合征16 例、13 三體綜合征4 例、性染色體異常17 例, 其中18 三體同時(shí)性染色體數(shù)目異常1 例、衍生Y 性染色體異常1 例、易位型13 三體1 例、18 三體嵌合體1 例。漏檢23 例, 10 例為嵌合體,13 例為結(jié)構(gòu)異常, 其中10 例嵌合體包括7 例染色體數(shù)目異常嵌合和3 例染色體結(jié)構(gòu)異常嵌合。見表2。

表2 1935例羊水QF-PCR檢測結(jié)果及染色體核型分析結(jié)果(n)

3 討論

染色體異常胎兒常合并智力低下、多發(fā)畸形、發(fā)育障礙、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常以及成年后的各種疾病的發(fā)生, 是影響出生人口素質(zhì)的重要原因。21 三體、18 三體、13 三體、性染色體異常是新生兒出生缺陷最常見的染色體異常的類型, 產(chǎn)前對胎兒進(jìn)行染色體非整倍體疾病篩查是降低出生缺陷率的重要方法［4］。

QF-PCR 是目前臨床應(yīng)用較廣的一種產(chǎn)前染色體異常的檢測方法, 主要是通過對STRs 擴(kuò)增, 快速診斷染色體數(shù)目拷貝異常的一種方法。QF-PCR 能提供高度完整的遺傳信息,具有高敏感性、高特異性和高效性等優(yōu)點(diǎn)。本研究中對1940例羊水樣本行QF-PCR 檢測, 21、18、13 和性染色體分別選用5、5、4、8 個(gè)STRs 位點(diǎn)。所有結(jié)果均在72 h 內(nèi)得出。共檢出97 例(5.00%)異常病例, 多由高齡孕婦的卵子在減數(shù)分裂時(shí)染色體不分離所致。此外, 研究共漏檢23 例, 多為嵌合性異常類型。這是因?yàn)樯鲜鼋Y(jié)構(gòu)異常并不在QF-PCR 檢測范圍內(nèi), 其解決方法包括是對非超聲異常病例進(jìn)一步的進(jìn)行核型分析, 以避免漏掉一部分結(jié)構(gòu)異常和一些低水平嵌合體。但與此同時(shí), 該結(jié)果的出現(xiàn)也表明QF-PCR 技術(shù)的檢測存在一定局限性, 即診斷對信息量要求較高, 當(dāng)STR 位點(diǎn)特異性不高時(shí), 容易出現(xiàn)漏診現(xiàn)象［5］。其次, 研究［6-9］也指出目前應(yīng)用的QF-PCR 技術(shù)不能準(zhǔn)確檢測出染色體平衡易位或異常核型＜15%的三體細(xì)胞和＜20%單體細(xì)胞存在時(shí)嵌合體。

綜上所述, QF-PCR 檢測染色體非整倍體疾病具有較好的敏感性和特異性, 是一種簡便、可靠的產(chǎn)前診斷染色體非整倍體分子診斷技術(shù)。但是, QF-PCR 也存在一定的局限性,其診斷技術(shù)需要不斷完善和研究, 發(fā)掘出更多有價(jià)值的遺傳標(biāo)記。但在目前的產(chǎn)前臨床診斷中, QF-PCR 更適合作為一種輔助診斷方法。