吳育羅 涂海旋 官哲

隨著生物技術(shù)不斷發(fā)展, 特別是細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步, 使腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療成為手術(shù)、化療、放療后惡性腫瘤的第四種治療手段［1］。既往的研究與臨床實(shí)踐顯示, 腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療應(yīng)該是一種比較理想、療效良好的腫瘤治療手段, 然而目前在臨床應(yīng)用上的療效并不能讓醫(yī)師及患者滿意, 仍存在細(xì)胞活性差、抗瘤譜局限的缺點(diǎn)［2-4］。利用細(xì)胞因子之間的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)機(jī)制, 協(xié)同增強(qiáng)彼此的生物學(xué)功能,有望進(jìn)一步提高腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療的臨床療效。本研究探討了IL-2、IL-21 誘導(dǎo)人外周血單個核細(xì)胞及其抗腫瘤作用, 現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 在2017年9月~2018年2月抽取正常健康人的外周血, 并應(yīng)用Ficoll密度梯度法分離PBMC, 制作成細(xì)胞懸液(1×106/ml), 并分為對照組、IL-2 組、IL-21 組和聯(lián)合組。對照組加入0.1 ml生理鹽水, IL-2組加入100 IU /ml的IL-2, IL-21組加入100 IU/ml的IL-21, 聯(lián)合組加入IL-2、IL-21各50 IU/ml。四組均放置在37℃并在含有5% CO2的孵箱中培養(yǎng), 共培養(yǎng)4 d。

1.2 方法

1.2.1 PBMC活細(xì)胞計(jì)數(shù) 在培養(yǎng)第4天后收獲PBMC, 在倒置顯微鏡下觀察, 并計(jì)算活細(xì)胞, 連續(xù)3次, 取平均值。

1.2.2 PBMC表型測定 應(yīng)用PBS洗滌各組PBMC, 分別加入PE-CD56與FITC-CD3, 在4℃環(huán)境下避光染色30 min, 并連續(xù)使用PBS洗滌2次, 然后使用流式細(xì)胞儀檢測四組的CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平。

1.2.3 腫瘤細(xì)胞殺傷率測定 使用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)測定, 取培養(yǎng)4 d的PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞(E), 以對數(shù)生長期的4種腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞(T), 稀釋靶細(xì)胞5×103/孔,效靶比例(E∶T)為20∶1, 然后計(jì)算腫瘤細(xì)胞殺傷率。

1.3 觀察指標(biāo) 比較四組的活細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平以及腫瘤細(xì)胞殺傷率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組活細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 聯(lián)合組、IL-2組、IL-21組、對照組的活細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(0.02±0.01)、(0.31±0.05)、(0.42±0.06)、(0.69±0.08), 聯(lián)合組、IL-2組、IL-21組活細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯高于對照組, 聯(lián)合組的活細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于IL-2組、IL-21組, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 四組CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平比較 聯(lián)合組、IL-2組、IL-21組的CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平均高于對照組, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 四組CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平

表1 四組CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平

注：與對照組比較, aP＜0.05

組別 CD3-/CD56+ CD3+/CD56+IL-2組 20.61±3.98a 3.08±1.68a IL-21組 18.23±3.99a 3.02±1.61a聯(lián)合組 25.77±4.89a 5.72±1.98a對照組 10.11±3.01 1.02±0.60

2.3 四組腫瘤細(xì)胞殺傷率比較 聯(lián)合組對人胃癌細(xì)胞系M85、胃癌細(xì)胞系BGC823、結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系HCT8的殺傷率分別為41.0%、40.0%、19.0%、16.0%, 均明顯高于IL-2組、IL-21組及對照組, 且IL-2組、IL-21組的腫瘤細(xì)胞殺傷率均明顯高于對照組, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 四組腫瘤細(xì)胞殺傷率比較(%)

3 討論

IL-21 是IL-2 細(xì)胞因子家族的新成員, 主要是由活化CD4+T 細(xì)胞分泌出來的, 在B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)以及單核來源的樹突狀細(xì)胞(DC 細(xì)胞)上都能夠發(fā)現(xiàn)其受體。IL-21 是一種多效因子, 但是對人體免疫細(xì)胞活化的影響目前還未可知, 因此在探討IL-21 對于PBMC 的誘導(dǎo)作用以及對腫瘤的殺傷性是非常有必要的。

大量研究顯示, 多種細(xì)胞因子的聯(lián)合應(yīng)用是能夠減低單一細(xì)胞因子用量, 多種細(xì)胞因子與淋巴細(xì)胞之間通過存在的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機(jī)制誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞, 可以提高腫瘤過繼性免疫治療的療效［5,6］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn), IL-2、IL-21 都能夠增強(qiáng)人體NK 和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL 細(xì)胞)功能［7］。有研究顯示, 黑素瘤小鼠在應(yīng)用過繼性T 細(xì)胞移植之后, DC 細(xì)胞上的黑素瘤接受疫苗后在應(yīng)用IL-2、IL-21 聯(lián)合治療, 相較于IL-2、IL-21 單獨(dú)使用治療, 聯(lián)合治療的療效比較顯著, T 細(xì)胞的應(yīng)答比較好, 抗腫瘤的活性比較持久［8］。IL-2、IL-21聯(lián)合使用能夠?qū)K 細(xì)胞分化成一種成熟的細(xì)胞, 以促進(jìn)穿孔素的表達(dá), 從而讓NK 細(xì)胞出現(xiàn)脫粒或增強(qiáng)細(xì)胞溶解性的能力。本研究發(fā)現(xiàn), IL-2、IL-21 聯(lián)合使用對NK 和CTL 細(xì)胞是能夠產(chǎn)生誘導(dǎo)激活作用的。IL-21 能夠在影響NK 細(xì)胞的同時, 通過NK 細(xì)胞內(nèi)的胞膜分子形成胞內(nèi)分子的表達(dá)從而調(diào)節(jié)NK 細(xì)胞的活性。人體試驗(yàn)與小鼠試驗(yàn)結(jié)果是不一樣的, IL-2、IL-21 必須聯(lián)合使用才能夠有效地維持人體的NK細(xì)胞存活, 并能夠有效上調(diào)各種分子的表達(dá)。

從表2 可以看出, IL-2、IL-21 聯(lián)合使用不僅可以激活NK 和CTL 細(xì)胞, 還可以發(fā)揮特異性的抗腫瘤效應(yīng), 對于人體胃癌細(xì)胞的殺傷力明顯比結(jié)腸癌細(xì)胞以及結(jié)直腸癌細(xì)胞的殺傷力更強(qiáng)?？梢酝茰y, 這種抗腫瘤的類型以及功能上的差異和腫瘤細(xì)胞表達(dá)分子是有一定關(guān)聯(lián)的。免疫系統(tǒng)對于腫瘤的殺傷力是建立在免疫能夠識別的基礎(chǔ)上, 因此在腫瘤免疫中, 細(xì)胞的免疫學(xué)特性是非常重要的。但是因?yàn)槟[瘤免疫學(xué)特性的多樣性, 因此必須根據(jù)腫瘤細(xì)胞免疫學(xué)特征制定相應(yīng)的治療方案, 才能夠有效地提高免疫治療的抗腫瘤作用。

綜上所述, IL-2、IL-21 聯(lián)合使用能夠誘導(dǎo)人的PBMC,且抗腫瘤作用比較顯著, 值得在臨床推廣。