王雪 李巧玲 高云云

[摘要]目的 探討吡非尼酮聯(lián)合尼達(dá)尼布聯(lián)合治療肺纖維化的效果和方法。方法 選取90只清潔級6～8周齡雄性昆明小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)取10只作為對照組，其余80只用博來霉素制備肺纖維化模型，用Buxco動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)測定小鼠的肺功能，Penh值上升至1.50以上顯示造模成功。從造模成功的小鼠中隨機(jī)抽取40只，隨機(jī)分為對照組（0.1 ml生理鹽水，每天3次）、吡非尼酮組（400 mg/kg，每天3次）、尼達(dá)尼布組（150 mg/kg，每天2次）、吡非尼酮（400 mg/kg，每天3次）聯(lián)合尼達(dá)尼布組（150 mg/kg，每天2次），連續(xù)給藥3周。上法測定肺功能的Penh值，然后將小鼠麻醉后處死，收集肺泡灌洗液，離心獲得取細(xì)胞，采用瑞士-姬姆薩染色后，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)小鼠肺泡灌洗液中的白細(xì)胞。結(jié)果 80只小鼠造模，50只小鼠（62.5%）造模成功。治療后，吡非尼酮聯(lián)合尼達(dá)尼布組的肺功能Penh值小于吡非尼酮組（P<0.05）、尼達(dá)尼布組（P<0.05）和對照組（P<0.01）。吡非尼酮聯(lián)合尼達(dá)尼布組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)少于吡非尼酮組（P<0.05）、尼達(dá)尼布組（P<0.05）和對照組（P<0.01）。結(jié)論 吡非尼酮聯(lián)合尼達(dá)尼布的治療效果最佳，為臨床使用該方法治療肺纖維化奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]吡非尼酮;尼達(dá)尼布;聯(lián)合治療;特發(fā)性肺纖維化

[中圖分類號] R332? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）3（c）-0038-03

[Abstract] Objective To explore the effect and method of Pirfenidone combined with Nintedanib treating pulmonary fibrosis in mice. Methods All of 90 male Kunming mice aged 6-8 weeks were selected， After 1 week of adaptive feeding， and among them， 10 mice were randomly selected as control group， and the other 80 mice were treated with Bleomycin to establish pulmonary fibrosis model. The pulmonary function of the mice was measured by Buxco animal pulmonary function analysis system. The Penh value increased to more than 1.5， and the model was established successfully. 40 model mice were selected randomly from successful mice modeling and randomly divided into control group （0.1 ml normal saline， 3 times a day）， Pirfenidone group （400 mg/kg， 3 times a day）， Nintedanib group （150 mg/kg， 2 times a day）， Pirfenidone （400 mg/kg， 3 times a day） combined with Nintedanib group （150 mg/kg， 2 times a day）. The mice were gavaged for 3 weeks. Penh value was measured using the above-mentioned method. Then the mice were sacrificed after anaesthetized. The alveolar lavage fluid was collected and centrifuged， then the cells were obtained. After Swiss-Giemsa staining， the white cells in alveolar lavage fluid of mice were counted under inverted microscope. Results? A total of 80 mice were modeled and 50 mice （62.5%） were successfully modeled. After treatment， the Penh value in Pirfenidone group combined with Nintedanib group were lower than those in Pirfenidone group （P<0.05）， Nintedanib group （P<0.05） and control group （P<0.01）. The leukocyte of Pirfenidone combined with Nintedanib group was fewer than that of Pirfenidone group （P<0.05）， Nintedanib group （P<0.05） and control group （P<0.01）. Conclusion The therapeutic effect of Pirfenidone combined with Nintedanib is the best， which lays a foundation for the clinical use of this method in the treatment of pulmonary fibrosis.

[Key words] Pirfenidone; Nintedanib; Combined treatment; Idiopathic pulmonary ifbrosis

肺纖維化是臨床上常見肺部疾病，它是由多種因素引起的慢性進(jìn)行性纖維化肺炎，組織學(xué)上表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，該類疾病的病理特點(diǎn)表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)、成纖維細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積[1]，其發(fā)病率正逐年增高，病死率較高。

肺纖維化治療一直是醫(yī)學(xué)界的難題，吡非尼酮和尼達(dá)尼布是臨床常用的治療藥物，2014年10月，美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)該2種藥物用于治療特發(fā)性肺纖維化[2]。吡非尼酮具有抗纖維化、抗炎和抗氧化作用，體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)顯示，吡非尼酮能通過抑制致纖維化因子，如血小板衍化生長因子（PDGF）和成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等的過度表達(dá)，從而減少成纖維細(xì)胞的增殖和膠原的合成和積累，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[3-5]。尼達(dá)尼布是新一代治療特發(fā)性肺纖維化藥物，主要抑制致纖維化因子受體，如血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）、血小板衍化生長因子受體（PDGFR）與纖維母細(xì)胞生長因子受體 （FGFR）等，進(jìn)而抑制纖維化進(jìn)程[6-9]，且臨床使用相對安全。

吡非尼酮和尼達(dá)尼布在臨床上常單獨(dú)使用，治療機(jī)制分別通過細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體起作用，兩者聯(lián)合使用還未有研究，聯(lián)合治療的效果和方法還未知，本項(xiàng)目試用該兩種藥物聯(lián)合治療動(dòng)物肺纖維化，初步探索其治療效果和治療方法。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

選取昆明小鼠，雄性90只，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證編號：SCXK（魯）20140007，鼠齡為6～8周，體重（35±2）g，常規(guī)飼養(yǎng)于無特定病原體環(huán)境。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究遵循國家制定的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南，并經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2016040）。

1.2主要試劑和儀器

吡非尼酮購自北京康蒂尼藥業(yè)有限公司（批號H20133376）和尼達(dá)尼布購自杭州民生藥物研究院（批號MS20140301）;博來霉素購自日本化藥株式會社（批號20100512）;戊巴比妥鈉購自中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司（批號F20020915）;瑞士染液、吉姆薩染色和生理鹽水等常規(guī)試劑購自泰安普天科技有限公司。

Buxco小動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)由美國BUXCO公司生產(chǎn)，型號為PFT;倒置顯微鏡由日本尼康公司生產(chǎn)，型號為TS100。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1造模? 把小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)抽取10只作為對照組，其余80只作為模型組。用3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，切開頸部皮膚，模型組用注射器穿刺氣管注入2 mg/kg的博來霉素，然后縫合皮膚。對照組同法注入生理鹽水。采用Buxco動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)測定小鼠的肺功能，記錄Penh值。

1.3.2分組? 把制備的肺纖維化小鼠模型常規(guī)飼養(yǎng)，用Buxco動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)測定小鼠的肺功能，Penh值上升至1.50以上顯示造模成功，從造模成功的小鼠中隨機(jī)抽取40只，隨機(jī)分成4組，每組10只，分別為對照組、吡非尼酮組、尼達(dá)尼布組、吡非尼酮和尼達(dá)尼布組（分別編號為1、2、3、4組）。

1.3.3給藥? 1、2、3、4組分別灌胃生理鹽水（0.1 ml生理鹽水，每天3次）、吡非尼酮（400 mg/kg，每天3次）、尼達(dá)尼布（150 mg/kg，每天2次），吡非尼酮（400 mg/kg，每天3次）和尼達(dá)尼布（150 mg/kg，每天2次），連續(xù)用藥3周。每天觀察小鼠、稱重等。采用上法測定肺功能，記錄Penh值。麻醉后處死小鼠，結(jié)扎左肺，灌洗右肺肺泡，收集肺泡灌洗液，取上清液，離心后，取沉淀，涂片，晾干后進(jìn)行瑞士-吉姆薩染色，先用瑞士染液染色4 min，水洗，吉姆薩染液染色2 min，水洗，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。

1.4觀察指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

造模后觀察小鼠的精神狀態(tài)、反應(yīng)快慢、進(jìn)食、大小便、體重等。以肺功能Penh值作為造模成功與否的指標(biāo)，以肺功能Penh值和白細(xì)胞數(shù)作為治療效果評價(jià)的指標(biāo)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用x±s表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠肺功能Penh值的比較

建模7 d后，對照組小鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)機(jī)敏，進(jìn)食飲水正常，大小便正常;實(shí)驗(yàn)組小鼠精神狀態(tài)較差，反應(yīng)慢，進(jìn)食和飲水減少。建模21 d，模型組小鼠體重（37.13 g）小于對照組（39.62 g）（P<0.05）。3周后，對照組的肺功能Penh值為0.48，模型組的肺功能Penh值上升至1.82。模型組肺功能的Penh值大于對照組（P<0.05）。80只小鼠造模成功50只，造模率為62.5%。

從50只造模成功的小鼠中隨機(jī)篩選40只，隨機(jī)分為4組。經(jīng)過3周治療后，對照組的肺功能Penh值為1.68，吡非尼酮組降低至1.21、尼達(dá)尼布組降低至1.32，吡非尼酮和尼達(dá)尼布組的肺功能Penh值降低至0.49。吡非尼酮和尼達(dá)尼布聯(lián)合治療組肺功能Penh值顯著小于吡非尼酮組（P<0.05）、尼達(dá)尼布組（P<0.05）和對照組（P<0.01）。吡非尼酮組和尼達(dá)尼布組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2各組小鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較

從50只造模成功的小鼠中隨機(jī)篩選40只，隨機(jī)分為4組。經(jīng)過3周治療后，對照組的肺泡灌洗液白細(xì)胞計(jì)數(shù)為5.82×105/ml，吡非尼酮組3.11×105/ml、尼達(dá)尼布組3.43×105/ml，吡非尼酮和尼達(dá)尼布組2.71×105/ml。其中聯(lián)合治療組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)少于對照組（P<0.01）、吡非尼酮組（P<0.05）和尼達(dá)尼布組（P<0.05），吡非尼酮組和尼達(dá)尼布組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

肺纖維化是一種慢性炎癥性間質(zhì)性疾病，以肺間質(zhì)彌漫性滲出、浸潤和纖維化為主要病變，肺纖維化的5年生存率為30%～50%，是一種嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病。導(dǎo)致肺纖維化的原因很多，常見的誘發(fā)因素包括藥物、吸煙、粉塵、空氣污染、病毒感染、胃食管返流以及遺傳因素等，一些風(fēng)濕免疫性疾病也可伴發(fā)肺纖維化[10]。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于肺纖維化缺乏特效治療手段，多采用的藥物包括糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和抗纖維化制劑，但療效不佳且毒副作用明顯[11-12]。目前治療研究的焦點(diǎn)也開始從抗炎向抗纖維化轉(zhuǎn)變，一些抗纖維化的藥物，如吡啡尼酮、尼達(dá)尼布等已顯現(xiàn)出較為理想的治療前景[13-15]。

由于藥物的副作用等因素，利用動(dòng)物模型研究是主要的方法之一。目前肺纖維化的動(dòng)物模型有小鼠、大鼠等。小鼠具有個(gè)體小、易操作等特點(diǎn)是常用制備肺纖維化的理想模型。博萊霉素是常用抗生素，也是廣譜性抗腫瘤藥，其對多種腫瘤有效。但使用過程中的副作用之一是引起肺纖維化。博來霉素能夠在較短的時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺纖維化，所以是用來制備肺纖維動(dòng)物模型常用的藥物[16-18]。因此本實(shí)驗(yàn)將其注入小鼠氣管制備肺纖維化模型，從肺功能Penh值上升可看出成功制備了小鼠肺纖維化模型。

目前肺纖維化缺乏特效藥。常用的藥物包括伊馬替尼、安倍生坦、強(qiáng)的松、硫唑嘌呤等，雖然有一定的效果，但副作用大。吡非尼酮和尼達(dá)尼布是臨床上近幾年使用的新藥，一般單獨(dú)使用進(jìn)行治療，本實(shí)驗(yàn)采用吡非尼酮聯(lián)合尼達(dá)尼布治療小鼠肺纖維化，從肺功能Penh值和白細(xì)胞數(shù)下降看出治療效果優(yōu)于單獨(dú)使用。本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物水平發(fā)現(xiàn)了吡非尼酮和尼達(dá)尼布聯(lián)合治療肺纖維化有很好的治療效果，在臨床上對肺纖維化患者聯(lián)合使用是否也具有同樣的效果，有待于在臨床進(jìn)一步研究，聯(lián)合使用對機(jī)體的副作用也有待于進(jìn)一步探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1]牛曉娟.阿奇霉素對博來霉素致大鼠肺纖維化的干預(yù)作用及機(jī)制[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2012：8.

[2]郭敬文，張振玲，邵華，等.肺纖維化藥物治療機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2017，44（5）：633-637.

[3]趙玉珂，趙銘山，秦靜，等.吡非尼酮對特發(fā)性肺纖維化治療的研究進(jìn)展[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2013，19（9）：12-13.

[4]陳鈺清，閆永吉，仇美華，等.吡非尼酮治療肺纖維化的療效與安全性meta分析[J].臨床藥物治療雜志，2016，14（4）：13-22.

[5]邵明香，王維亭，趙專友，等.抗肺纖維化新藥吡非尼酮[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2013，28（3）：409-414.

[6]蔡穎.尼達(dá)尼布在呼吸系統(tǒng)疾病治療中的臨床評價(jià)[J].世界臨床藥物，2013，34（10）：631-633.

[7]邢潔，張潔.治療特發(fā)性肺纖維化新藥尼達(dá)尼布的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2015，26（29）：4174-4176.

[8]劉傳梅，蔡后榮.特發(fā)性肺纖維化藥物治療進(jìn)展[J].臨床藥物治療雜志，2015，13（3）：1-4.

[9]陳卓.特發(fā)性肺纖維化病機(jī)制及藥物治療進(jìn)展[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2016：6-16.

[10]魏燕華，劉桂桃.肺纖維化的治療進(jìn)展[J].臨床肺科雜志，2014，19（2）：336-339.

[11]杜文靜，董競成.特發(fā)性肺纖維化的治療研究進(jìn)展[A]//第三屆民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)國際學(xué)術(shù)大會暨第十三次全國中西醫(yī)結(jié)合防治呼吸系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會論文集[C].2014：319-322.

[12]馬戰(zhàn)平，李猛，黃剛，等.特發(fā)性肺纖維化的中醫(yī)藥研究進(jìn)展[A]//全國第十九次中醫(yī)肺系病學(xué)術(shù)交流會暨2015年浙江省中醫(yī)藥學(xué)會呼吸病分會學(xué)術(shù)年會論文集[C].2015：1-7.

[13]唐連濤.特發(fā)性肺纖維化治療進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（9）：1309-1311.

[14]班健.特發(fā)性肺纖維化的治療進(jìn)展[J].臨床肺科雜志，2011，16（9）：1432-1434.

[15]奚菊美.基于靜電噴霧技術(shù)的尼達(dá)尼布納米增溶與緩釋體系的構(gòu)建及體內(nèi)外評價(jià)[D].鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2016：1-2.

[16]趙永強(qiáng)，楚海燕，滕禮，等.博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠模型的建立及特征[J].疑難病雜志，2013，12（9）：705-708.

[17]陳孟毅.小鼠博來霉素多次染毒肺纖維化模型建立及ABT263治療作用觀察[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2017：1-6.

[18]崔紅帥.阿奇霉素對博來霉素致小鼠肺纖維化中ILK及β-catenin蛋白表達(dá)的影響[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué).2017：1-8.

（收稿日期：2018-10-08? 本文編輯：許俊琴）