陳偉業(yè)，邢宏松，江帆，吳國俊，黎建軍，孫權(quán)，潘德銳

（武漢科技大學(xué)附屬普仁醫(yī)院 1.普通外科 3.外科教研室，湖北 武漢 430081；2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院 普通外科， 湖北 武漢430071）

胰腺癌是種常見的惡性腫瘤，中位生存期僅3～6個月，5年生存率不到5%[1]。據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)胰腺癌在男性中發(fā)病率為5.5/10萬，在女性中為4.0/10萬，全年共458918例新發(fā)病例，432242例胰腺癌相關(guān)死亡[2-3]。在我國，胰腺癌占所有癌癥相關(guān)死亡的4.54%[1]。由于胰腺位置較隱秘，在發(fā)現(xiàn)時往往已是晚期，預(yù)后不佳。尋找新的早期診斷靶標(biāo)和轉(zhuǎn)移靶點，對提高胰腺癌診療水平有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指長度超過200 nt且沒有開放閱讀框的RNA分子[4-5]。

人卵巢癌特異性轉(zhuǎn)錄體2（human ovarian cancer-specific transcript 2，HOST 2），是長鏈非編碼RNA家族成員之一，長度約2.9 kb，沒有明顯的開放閱讀框，被首先報道在卵巢癌中高表達(dá)[6]。lncRNA HOST2在三陰性乳腺癌[7]、肝細(xì)胞癌[8]、腦膠質(zhì)瘤[9]及上皮性卵巢癌[10]中異常表達(dá)，且參與調(diào)控增殖、凋亡、侵襲和遷移等腫瘤生物學(xué)進(jìn)程。然而，尚未見lncRNA HOST2在胰腺癌中的表達(dá)及功能。本研究旨在體外研究lncRNA HOST2在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及對增殖和遷移的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常胰腺細(xì)胞系HPDE6-C7及胰腺癌細(xì)胞系Panc-1、AsPC-1、BxPC-3和HPAC均由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗室饋贈，vimentin、Twist1和Snail一抗均購自美國Cell Signaling公司，GAPDH一抗購自美國Santa Cruz公司，二抗購自美國Santa Cruz公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自武漢博士德生物科技有限公司，Lipofectamine?3000 Transfection Reagent購自美國Thermo Fisher公司。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自ThermoFisher公司，qRT-PCR試劑盒購自上海吉瑪生物科技有限公司，熒光定量PCR儀購自美國ThermoFisher公司，lncRNA HOST2 siRNA、NT-siRNA序列均由上海吉瑪生物科技有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞分組將Panc-1細(xì)胞細(xì)胞系分成3組：lncRNA HOST2沉默表達(dá) 組（si-HOST2組）、陰性對照組及空白對照組，前兩組采用LipofectamineTM3000分別轉(zhuǎn)染lncRNA HOST2 siRNA、陰性對照siRNA[10]，空白對照組加入LipofectamineTM3000。lncRNA HOST2 siRNA序列正義鏈：5'-GAC UAA ACA AGG UCU UAA UTT-3'；反義鏈：5'-AUU AAG ACC UUG UUU AGU CTT-3',NT-siRNA序列正義鏈：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'；反義鏈：5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3'，轉(zhuǎn)染濃度為300 nmol/孔。

1.2.2 qRT-PCR提取3組細(xì)胞總RNA后，采用反轉(zhuǎn)錄法合成cDNA，GAPDH為內(nèi)參，lncRNA HOST2引物序列：上游引物，5'-GGA CAG GTC CCT TGT TTC AA-3'；下游引物， 5'-CTG GTC TTT CCT TGC CTC TG-3'；GAPDH上游引物：5'-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3'；下游引物：5'-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3'。定量采用2-ΔΔCt法，GAPDH為內(nèi)參，在95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個循環(huán)的反應(yīng)條件下，測定si-HOST2組、陰性對照組及空白對照組3組樣品的循環(huán)閾值，采用2-ΔΔCt法定量，計算lncRNA HOST2的相對表達(dá)量。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力測定采用MTT法測定si-HOST2組、陰性對照組及空白對照組細(xì)胞增殖能力，將3組細(xì)胞以2×103個/孔的標(biāo)準(zhǔn)種植，培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后，加入MTT 20 μL于每孔中，在450 nm波長下，采用DNM-9606酶標(biāo)分析儀測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制增殖曲線。

1.2.4 細(xì)胞遷移能力測定細(xì)胞劃痕實驗用來檢驗細(xì)胞遷移能力：將3組細(xì)胞培養(yǎng)至無菌孔板后，無菌吸液槍頭畫融合后的細(xì)胞，觀察修復(fù)時間為0、24 h，計算劃痕愈合率，即=（劃痕后即刻的劃痕面積-劃痕后24 h的劃痕面積）/劃痕后即刻的劃痕面積×100%。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.5 細(xì)胞侵襲能力測定Transwell實驗用來檢驗細(xì)胞侵襲能力：將3組細(xì)胞按每組1×104個細(xì)胞數(shù)接種于Transwell小室表面，經(jīng)培養(yǎng)24 h后，甲醛固定穿過室膜下的細(xì)胞，染色液采用0.2%結(jié)晶紫溶液，染色后，在顯微鏡下（200×）計算穿膜細(xì)胞數(shù)，實驗重復(fù)3次，取平均值。穿膜細(xì)胞數(shù)與侵襲能力成正比。

1.2.6 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白Western blot檢測裂解變性3組細(xì)胞，跑膠條件：濃縮膠80 V 60 min，分離膠100 V 90 min，加入vimentin、Twist1和Snail及GAPDH一抗（1:400）于4℃孵育過夜，二抗（1:1000）孵育，ECL液顯影，計算灰度值，重復(fù)3次實驗后取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA HOST2在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR示：人正常胰腺細(xì)胞系HPDE6-C7中l(wèi)ncRNA HOST2的相對表達(dá)量為1.05±0.03，胰腺癌細(xì)胞系Panc-1、AsPC-1、BxPC-3、HPAC中l(wèi)ncRNA HOST2的相對表達(dá)量分別為13.48±0.95、7.53±0.62、2.87±0.21、2.16±0.15，胰腺癌細(xì)胞系Panc-1、AsPC-1、BxPC-3及HPAC中l(wèi)ncRNA HOST2的相對表達(dá)量均明顯高于HPDE6-C7細(xì)胞系（均P＜0.05）（圖1）。

圖1 lncRNA HOST2在不同胰腺癌細(xì)胞系及正常胰腺細(xì)胞系中的表達(dá)Figure1 The expressions of lncRNA HOST2 in different pancreaticcancer cell lines and normal pancreatic epithelial cell lines

2.2 轉(zhuǎn)染效率測定

轉(zhuǎn)染24h后，si-HOST2組與陰性對照組lncRNA HOST2表達(dá)量分別為0.18±0.03、1±0.06，si-HOST2組lncRNA HOST2表達(dá)量明顯低于陰性對照組與空白對照組（均P＜0.01）；陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果Figure2 Results of transfection efficiency

2.3 lncRNA HOST2沉默對Panc-1細(xì)胞增殖的影響

MTT實驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染24 h以內(nèi)各組OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），轉(zhuǎn)染48 h后，si-HOST組OD值明顯低于空白對照組與陰性對照組（均P＜0.05），而陰性對照組與空白對照組在各時間點OD值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）（圖3）。

圖3 各組細(xì)胞增殖曲線比較Figure3 Comparison of the proliferation curves of three groups of cells

2.4 lncRNA HOST2沉默對Panc-1細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞劃痕實驗示：si-HOST2組細(xì)胞劃痕愈合率為（30.5%±3.8）%，陰性對照組劃痕愈合率為（64.8%±6.1）%，空白對照組劃痕愈合率為（62.5±5.2）%，si-HOST2組細(xì)胞劃痕愈合率明顯低于陰性對照組與空白對照組（均P＜0.001）；陰性對照組與空白對照組劃痕愈合率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

2.5 lncRNA HOST2沉默對Panc-1細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實驗示：200倍視野下，si-HOST2組侵襲細(xì)胞數(shù)為（136±25）個，陰性對照組為（381±53）個，空白對照組為（374±48）個，si-HOST2組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性對照組與空白對照組（均P＜0.05），而陰性對照組與空白對照組侵襲細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖5）。

圖4 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果Figure4 Results of cell wound scratch assay

圖5 Transwell實驗結(jié)果Figure5 Results of Transwell assay

2.6 lncRNA HOST2沉默對EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot示：si-HOST2組vimentin、Twist1、Snail蛋白表達(dá)量均明顯低于陰性對照組與空白對照組（均P＜0.001），而3種蛋白的表達(dá)量在空白對照組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）（圖6）。

圖6 EMT相關(guān)蛋白Western blot檢測結(jié)果Figure6 Results of Western blot analysis for EMT-associated proteins

3 討 論

研究報道，多種LncRNA與胰腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。比如，lncRNA HOTAIR在胰腺癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，體外實驗顯示其能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖與侵襲[11]。lncRNA MALAT1在胰腺癌中異常高表達(dá)，與腫瘤大小、分期、浸潤程度及預(yù)后差相關(guān)，是影響預(yù)后的獨立危險因子，體外研究顯示沉默lncRNA MALAT1表達(dá)可抑制細(xì)胞周期和EMT進(jìn)程[12]。其他影響胰腺癌預(yù)后的lncRNA包括lncRNA AGAP2-AS1[13]、lncRNA RP11-567G11.1[14]、lncRNA CASC2[15]等。

lncRNA HOST2是一個長度為2.9 k b的lncRNA，其在多種腫瘤中異常高表達(dá)，且與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)[16]。在上皮性卵巢癌中，lncRNA HOST2異常高表達(dá)，抑制lncRNA HOST2表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲和增殖能力顯著減弱[10]。在骨肉瘤中，lncRNA HOST2高表達(dá)，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖，沉默lncRNA HOST2可顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)凋亡[16]。在三陰性乳腺癌中，沉默lncRNA HOST2可抑制乳腺癌增殖[7]。在肝細(xì)胞癌中，lncRNA HOST2可促進(jìn)EMT進(jìn)程，通過JAK2-STAT3 信號通路影響促進(jìn)增殖、遷移和侵襲[8]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，發(fā)現(xiàn)lncRNA HOST2與微小RNA let-7b呈負(fù)相關(guān)，在體外沉默lncRNA HOST2表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系增殖、遷移和侵襲，在動物實驗中可抑制克隆形成及腫瘤形成[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，相對于正常胰腺上皮細(xì)胞系HPDE6-C7，胰腺癌細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA HOST2高表達(dá)，這與其它腫瘤[7-10]中的表達(dá)趨勢一致，提示lncRNA HOST2在胰腺癌中可能發(fā)揮促癌基因的功能。

為進(jìn)一步探討lncRNA HOST2的功能，本研究挑選lncRNA HOST2相對表達(dá)量最高的胰腺癌細(xì)胞系Panc-1，并經(jīng)轉(zhuǎn)染沉默其表達(dá)，行MTT實驗，發(fā)現(xiàn)si-HOST2組OD值顯著低于陰性對照組與空白對照組，提示沉默lncRNA HOST2表達(dá)后，可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞系增殖。這與上皮性卵巢癌[10]、肝細(xì)胞癌[8]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[9]及骨肉瘤[16]中的結(jié)果一致，在吉他西濱耐藥的胰腺癌細(xì)胞系中，沉默lncRNA HOST2的表達(dá)可抑制增殖并促進(jìn)凋亡[17]。

EMT是一個上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的過程，在此過程中，上皮細(xì)胞間黏連減弱、失去極性并獲得間質(zhì)細(xì)胞特性、運動能力增強(qiáng)[18]。與EMT密切相關(guān)的標(biāo)志物包括Snail、Twist1和vimentin等[19-20]。Snail是EMT過程中E-caherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子，Snail過表達(dá)不僅可促進(jìn)EMT的發(fā)生，還可增加細(xì)胞的遷移和侵襲能力[21]。Twist1是EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子之一，可下調(diào)上皮表型基因如E-cadherin，上調(diào)表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表型基因如vimentin，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤遷移和侵襲[22-23]。vimentin是一種3型中間絲蛋白，負(fù)責(zé)維持細(xì)胞形狀和穩(wěn)定細(xì)胞骨架，是重要的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，vimentin可調(diào)節(jié)細(xì)胞的可塑性，與腫瘤的預(yù)后差和高轉(zhuǎn)移率相關(guān)[24-26]。

本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HOST2沉默后，s i-HOST2組劃痕愈合率顯著低于陰性對照組和空白對照組，侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于陰性對照組和空白對照組，提示沉默lncRNA HOST2可抑制胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。Western blot示，si-HOST2組Snail、Twist、vimentin表達(dá)量顯著低于陰性對照組和空白對照組，提示沉默lncRNA HOST2表達(dá)可能通過抑制Snail、Twist、vimentin的表達(dá)，影響EMT過程，進(jìn)而抑制胰腺癌細(xì)胞遷移。

當(dāng)然，由于本研究是體外實驗，尚存在一定不足：首先lncRNA HOST2調(diào)控Snail、Twist1和vimentin表達(dá)的確切機(jī)制尚不完全清楚；其次lncRNA HOST2在動物體內(nèi)所起的作用如何，都值得進(jìn)一步研究。

綜上，lncRNA HOST2在胰腺癌細(xì)胞系中異常高表達(dá)，能通過調(diào)控Snail、Twist1和vimentin表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力，發(fā)揮促癌基因的功能。這提示LncRNAHOST2可能作為胰腺癌的潛在診斷和轉(zhuǎn)移靶標(biāo)。