曹智修，柳懿鵬，章傳華，袁敬東

(武漢市第一醫(yī)院泌尿外科，武漢 430022)

腎缺血-再灌注損傷在臨床工作中較為常見(jiàn)，尤其在腎部分切除術(shù)、腎移植術(shù)、腎血管成形術(shù)以及腎臟及周圍組織器官長(zhǎng)時(shí)間氣腹操作等腔鏡手術(shù)中不可避免。腎缺血-再灌注損傷中氧化損傷是關(guān)鍵[1]。綠茶是東方人喜愛(ài)的飲品，具有較好的抗氧化作用和抗癌作用。筆者擬觀察綠茶中主要成分綠茶多酚對(duì)腎缺血-再灌注氧化損傷的影響，為開(kāi)發(fā)新藥提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(220±10) g，合格證號(hào)：20161108X-01，購(gòu)自武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2014-0012。將大鼠從1～30編號(hào)后用隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血-再灌注組(I/R組)、綠茶多酚+缺血-再灌注組(I/R+G組)，每組各10只，分籠飼養(yǎng)于室溫25～27 ℃、相對(duì)濕度60%、自由飲食飲水的環(huán)境中。所有動(dòng)物飼養(yǎng)及手術(shù)操作均在武漢市第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，動(dòng)物處理獲得華中科技大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵循華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定執(zhí)行。

1.2灌藥及手術(shù)處理 將綠茶多酚(陜西森佛天然制品有限公司，含量：99%，批號(hào)：WS20140231)1 g溶入0.9%氯化鈉溶液100 mL中，配制成10 mg·mL-1灌胃液，I/R組和I/R+G組大鼠分別給予0.9%氯化鈉溶液和綠茶多酚每天灌胃1次，根據(jù)大鼠體質(zhì)量按照60 mg·kg-1的劑量灌胃，持續(xù)4周。持續(xù)綠茶多酚灌胃結(jié)束后，所有大鼠以戊巴比妥鈉(上海中西藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：WS20130113)腹腔注射麻醉，暴露左側(cè)腎蒂，I/R組和I/R+G組參照ARAVINDAN等[2]介紹的方法，動(dòng)脈夾阻斷左腎動(dòng)靜脈50 min，左腎動(dòng)靜脈血流恢復(fù)后60 min切取左側(cè)腎臟，Sham組麻醉后，暴露左側(cè)腎蒂110 min后切取左側(cè)腎臟，動(dòng)物處死后所獲得腎臟分為兩部分行指標(biāo)檢測(cè)。

1.3超氧化物趨化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測(cè) 所獲取的組織用0.9%氯化鈉溶液將表面血跡清洗干凈后，加入組織裂解液，離心后收集上清液，一部分通過(guò)二喹啉甲酸(BCA)法對(duì)上清液行蛋白濃度檢測(cè)，另一部分通過(guò)羥胺法測(cè)定SOD吸光度值，通過(guò)TAB法測(cè)定MDA吸光度值。并結(jié)合蛋白濃度計(jì)算SOD活力和MDA含量。蛋白測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20151105)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，SOD(批號(hào)：20161203)和MDA(批號(hào)：20161124)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4腎損傷分子-1(KIM-1)表達(dá)檢測(cè) 所獲取腎組織浸泡于10%多聚甲醛后，石蠟包埋固定，切片機(jī)切成厚度5 μm薄片于載玻片上，經(jīng)脫蠟、脫水、抗原修復(fù)后，加兔抗鼠KIM-1(美國(guó)CST公司，批號(hào)：2017003206001)一抗于4 ℃過(guò)夜，沖洗干凈后加入羊抗兔二抗(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：20151140)并行著色、脫水、封片，于Olympus 70顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察并按照CAO等[3]介紹的方法計(jì)算每個(gè)視野的KIM-1表達(dá)評(píng)分。

1.5組織細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 切片的組織經(jīng)脫蠟、脫水后按凋亡試劑盒(瑞士羅氏試劑公司，批號(hào)：2017098760045)步驟通過(guò)TUNEL法進(jìn)行凋亡細(xì)胞標(biāo)記，隨后進(jìn)行著色、脫水、封片，于Olympus 70顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察，并計(jì)算每個(gè)視野的凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞總數(shù)/觀察總細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1SOD和MDA含量 Sham組SOD活性為(510.67±16.91) U·mg-1，經(jīng)缺血-再灌注處理后I/R組、I/R+G組SOD分別為(174.02±9.62)，(439.17±8.27) U·mg-1。Sham組和I/R+G組SOD明顯較I/R組高(P<0.05)。Sham組MDA含量為(0.02±0.03) nmol·mg-1，經(jīng)缺血-再灌注處理后I/R組、I/R+G組MDA含量分別為(4.10±0.09)，(1.78±0.08) nmol·mg-1。Sham組和I/R+G組MDA明顯較I/R組低(P<0.05)(圖1)。

2.2KIM-1 表達(dá) I/R組KIM-1表達(dá)明顯比Sham組和I/R+G組增強(qiáng)(圖2)，Sham組KIM-1表達(dá)評(píng)分為0.02±0.02，I/R組、I/R+G組KIM-1表達(dá)評(píng)分分別為4.52±0.11，1.98±0.09，Sham組和I/R+G組KIM-1表達(dá)評(píng)分值明顯較I/R組低(P<0.05)。

2.3腎小管細(xì)胞凋亡情況 I/R組凋亡的腎小管細(xì)胞明顯較Sham組和I/R+G組多，Sham組腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)為0.08±0.08，I/R組、I/R+G組腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為53.39±2.95，14.86±1.19，Sham組和I/R+G組腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯較I/R組低(P<0.05)( 圖3)。

3 討論

氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的過(guò)多活性氧基團(tuán)是造成缺血-再灌注過(guò)程中組織細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素[4-5]，脂質(zhì)過(guò)氧化物是腎臟缺血-再灌注氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，能夠損傷細(xì)胞脂質(zhì)層的結(jié)構(gòu)和功能[6-7]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，抗氧化劑治療能在一定程度上預(yù)防缺血-再灌注過(guò)程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物造成的損傷[8-9]。 綠茶多酚是從綠茶中提取的活性成分，具有很強(qiáng)的清除活性氧能力和抗氧化活性[10]，能夠緩解慢性疾病引起的氧化損傷，減少機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而起到改善機(jī)體因功能缺陷造成的損傷[11-13]。本研究結(jié)果顯示，綠茶多酚對(duì)大鼠缺血-再灌注氧化損傷腎臟具有保護(hù)作用。

SOD是氧化應(yīng)激過(guò)程中能夠特異性清除氧自由基的抗氧化酶，其活性高低通常能反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱[14]。MDA是機(jī)體遭受氧化損傷后產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物降解物。機(jī)體產(chǎn)生MDA后可導(dǎo)致組織細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，生物活性功能降低，同時(shí)MDA為細(xì)胞毒性物質(zhì)，本身會(huì)造成細(xì)胞損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)綠茶多酚干預(yù)處理后的大鼠SOD活力明顯較未干預(yù)組高，而MDA產(chǎn)生量低于未干預(yù)組，說(shuō)明綠茶多酚能夠有效增強(qiáng)腎臟組織抗氧化能力。

與I/R組比較，*1P<0.05

Compared with the I/R group，*1P<0.05

Fig.1SODandMDAcontentsinthreegroupsofrats(n=10)

KIM-1是腎臟損傷后表達(dá)于腎小管的跨膜蛋白，通常正常腎臟組織不表達(dá)，但當(dāng)腎臟缺血或毒性損傷后高表達(dá)，它是檢測(cè)腎臟損傷的敏感指標(biāo)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，Sham組無(wú)KIM-1表達(dá)，經(jīng)綠茶多酚干預(yù)的缺血-再灌注組和未經(jīng)綠茶多酚的缺血-再灌注組KIM-1均有不同程度表達(dá)，但未經(jīng)綠茶多酚干預(yù)組的KIM-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，說(shuō)明綠茶多酚在防止腎臟缺血-再灌注氧化損傷的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步降低了腎組織細(xì)胞的損傷。TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞也證實(shí)，經(jīng)綠茶多酚干預(yù)后缺血-再灌注腎臟腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯較未干預(yù)的缺血-再灌注腎臟低，說(shuō)明綠茶多酚有較好的降低腎臟缺血-再灌注損傷的功能

與I/R組比較，*1P<0.05

與I/R組比較，*1P<0.05