姚凌妍 沈建華

摘? ?要：分離篩選耐鹽的蛋白酶高產(chǎn)菌并加以鑒定。從廚余垃圾存放處土壤中分離細(xì)菌，利用蛋白水解透明圈初篩蛋白酶高產(chǎn)菌，并進(jìn)行蛋白酶高產(chǎn)菌的耐鹽試驗(yàn)，對(duì)所得的耐鹽蛋白酶高產(chǎn)菌進(jìn)行革蘭氏染色與半固體穿刺培養(yǎng)。從土壤中分離得到19個(gè)單菌落，在初篩培養(yǎng)基上點(diǎn)種接種，有4株有比較明顯的水解透明圈，其中P2，P3為蛋白酶高產(chǎn)菌，耐鹽試驗(yàn)表明P3最適鹽濃度為2%，為耐鹽高產(chǎn)菌株。P3革蘭染色陽(yáng)性，桿狀，產(chǎn)芽孢，好氧，有鞭毛。從廚余垃圾存放處的土壤中分離得到一株耐鹽的蛋白酶高產(chǎn)菌P3，為高滲條件下發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶提供了一種可能的菌種。

關(guān)鍵詞：蛋白酶? 耐鹽? 初篩? 鑒定

堿性蛋白酶、α-淀粉酶及糖化酶是三大工業(yè)酶制劑，其總產(chǎn)量約占酶類制劑的80%以上。催化蛋白質(zhì)水解的酶稱為蛋白酶，其中堿性條件下能水解蛋白質(zhì)中肽鍵的酶即堿性蛋白酶，其最適pH在9～11范圍內(nèi)，廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品、醫(yī)療、釀造、絲綢、制革等行業(yè)。因此，蛋白酶的生產(chǎn)在酶制劑乃至整個(gè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中占有重要的地位。蛋白酶廣泛分布于動(dòng)物、植物與微生物中。由于植物受生長(zhǎng)地域、季節(jié)、氣候等的影響，生產(chǎn)酶制劑的產(chǎn)量、質(zhì)量都不穩(wěn)定。動(dòng)物產(chǎn)生的酶主要從屠宰牲畜的腺體中提取，來(lái)源有限。只有微生物生產(chǎn)的酶，可滿足任何規(guī)模的需求，產(chǎn)率高、質(zhì)量穩(wěn)定。同時(shí)，微生物產(chǎn)生的蛋白酶通常為胞外酶，分泌到發(fā)酵液中，相較于動(dòng)植物來(lái)源的蛋白酶，分離純化的難度大大降低。工業(yè)上規(guī)?；囵B(yǎng)微生物時(shí)，出于提高產(chǎn)率的考量，一般培養(yǎng)液的濃度盡量提高，這就要求發(fā)酵菌種能夠耐受較高的滲透壓，往往使用耐高鹽的菌種。耐鹽的蛋白酶高產(chǎn)菌菌種的選育成為蛋白酶生產(chǎn)的關(guān)鍵。

本文擬從土壤中分離細(xì)菌，篩選出耐鹽的蛋白酶高產(chǎn)菌，并進(jìn)行初步鑒定，以期為蛋白酶生產(chǎn)提供可能的細(xì)菌菌株。

1? 材料與方法

1.1 土壤樣品稀釋液

從南京科技職業(yè)學(xué)院校園內(nèi)廚余垃圾存放處土地采集土樣，五點(diǎn)取樣，取表層以下5～10cm處的土樣，混勻，放入無(wú)菌的袋中備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)稱土樣1g，迅速倒入帶玻璃珠的99mL無(wú)菌水瓶中振蕩5～10min，使土樣充分打散，即成為10-2的土壤懸液。用無(wú)菌移液管吸10-2的土壤懸液1mL，放入9mL無(wú)菌水中即為10-3稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-3～10-8的稀釋液[1]。

1.2 土壤細(xì)菌的分離

1.2.1 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，加水至1000mL，調(diào)pH7.0～7.2，121℃滅菌20min。

1.2.2 土壤稀釋液平板澆注

取1mL土壤稀釋液接種至無(wú)菌培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基降溫至50℃趁熱倒平板，混勻，待平板凝固后，倒置，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，獲得細(xì)菌菌落。

1.2.3 分離培養(yǎng)基

牛肉膏2g，瓊脂15g，加水至800mL，121℃滅菌20min，脫脂牛奶200mL單獨(dú)滅菌，105℃，20min，各自滅菌后趁熱混合，自然pH。倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，即得劃線分離平板[2]。

1.2.4 平板劃線分離

從混勻澆注的平板上挑取單菌落，在無(wú)菌平板上進(jìn)行三區(qū)劃線分離，獲得純種。

1.3 蛋白酶產(chǎn)生菌的初篩

1.3.1 初篩培養(yǎng)基

脫脂奶粉10g，瓊脂10g，加水至1000mL，0.06MPa，115℃高壓滅菌10min。趁熱倒平板。

1.3.2 平板透明圈法初篩

將劃線分離得到的純種分別點(diǎn)種于初篩培養(yǎng)基上，每個(gè)平板點(diǎn)種2個(gè)菌株，倒置，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，測(cè)量所接菌株的水解圈的直徑（Dh）與菌落的直徑（Dc）。根據(jù)Dh與Dc的比值，確定各個(gè)菌株產(chǎn)蛋白酶能力的強(qiáng)弱，從而篩選出蛋白酶高產(chǎn)菌[3]，見(jiàn)表1。

1.4 蛋白酶高產(chǎn)菌的耐鹽試驗(yàn)

1.4.1 耐鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基

肉湯培養(yǎng)基中分別添加0%～9%（w/v）不等的氯化鈉，調(diào)pH7.0～7.2，121℃滅菌20min。

1.4.2 耐鹽試驗(yàn)

取初篩培養(yǎng)基上水解透明圈明顯的菌落，用接種環(huán)刮取一環(huán)，接入50mL肉湯培養(yǎng)基中，25℃恒溫?fù)u床150r/min震蕩培養(yǎng)18h至OD600為0.5作為種子液。在100mL不同氯化鈉濃度的肉湯培養(yǎng)基中分別準(zhǔn)確接入1mL種子液，25℃恒溫?fù)u床150r/min震蕩培養(yǎng)18h，測(cè)定OD600[4]。

1.5 耐鹽蛋白酶高產(chǎn)菌的初步鑒定

1.5.1 革蘭氏染色

用革蘭氏染色試劑盒進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5.2 半固體穿刺培養(yǎng)

用接種針挑取耐鹽蛋白酶高產(chǎn)菌，在半固體培養(yǎng)基上穿刺接種，考察其有無(wú)鞭毛及需氧情況。

2? 結(jié)果與討論

2.1 土壤細(xì)菌分離與純化結(jié)果

從南京科技職業(yè)學(xué)院校內(nèi)廚余垃圾存放處土壤樣品中，稀釋倒平板并在分離培養(yǎng)基上劃線分離得到19個(gè)菌落，依次編號(hào)。

2.2 蛋白酶產(chǎn)生菌初篩結(jié)果

19個(gè)單菌落點(diǎn)種于初篩培養(yǎng)基上，有4個(gè)能夠產(chǎn)生比較明顯的透明圈，4個(gè)菌株的Dh、Dc以及Dh/Dc見(jiàn)表1。比較不同菌株的Dh/Dc可知，P2與P3的Dh/Dc都在3以上，可初步判定為蛋白酶高產(chǎn)菌。

2.3 耐鹽試驗(yàn)結(jié)果

蛋白酶高產(chǎn)菌P2與P3的耐鹽試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知蛋白酶高產(chǎn)菌P2能在含0%～6%氯化鈉的肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，最適鹽濃度為1%;而蛋白酶高產(chǎn)菌P3能在含0%～7%氯化鈉的肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其最適鹽濃度為2%，且每個(gè)鹽濃度下，P3的光密度值都高于P2。因此，菌株P(guān)3是耐鹽的蛋白酶高產(chǎn)菌。

2.4 P3菌的初步鑒定

2.4.1 革蘭氏染色結(jié)果

P3菌株的革蘭氏染色結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知，P3菌革蘭氏染色結(jié)果呈陽(yáng)性，桿狀，產(chǎn)芽孢。

2.4.2 半固體培養(yǎng)結(jié)果

P3菌株半固體培養(yǎng)，在培養(yǎng)基表面及穿刺線上部生長(zhǎng)，表明該菌為好氧菌，且從穿刺線向四周擴(kuò)散生長(zhǎng)，表明其具有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。

3? 結(jié)語(yǔ)

本文從南京科技職業(yè)學(xué)院存放廚余垃圾處的土壤中稀釋倒平板并劃線分離得到19個(gè)菌落，將分離得到的單菌落點(diǎn)種于初篩培養(yǎng)基上，得到4株水解透明圈較明顯的菌株P(guān)1、P2、P3以及P4，其中P2與P3的Dh/Dc值在3以上，初步判定為蛋白酶高產(chǎn)菌。再對(duì)P2以及P3進(jìn)行耐鹽試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)P3菌株能在含0%～7%氯化鈉的肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，且最適鹽濃度為2%，遠(yuǎn)高于普通肉湯培養(yǎng)基中的0.5%的鹽濃度，具備耐鹽特性，因此P3菌具備耐高鹽蛋白酶高產(chǎn)菌的潛質(zhì)。針對(duì)P3菌進(jìn)行了初步的鑒定，革蘭染色陽(yáng)性，桿狀，產(chǎn)芽孢，半固體穿刺培養(yǎng)試驗(yàn)表明其具有鞭毛，好氧。P3菌是從廚余垃圾存放處的土壤中分離得到的。由于其生存環(huán)境中存在豐富的蛋白質(zhì)來(lái)源以及具備較高的鹽濃度的條件，所以易于分離得到耐鹽的蛋白酶高產(chǎn)菌。當(dāng)然，P3菌的蛋白酶產(chǎn)生能力還需要進(jìn)行復(fù)篩，并進(jìn)行發(fā)酵液的酶活力測(cè)定，這是筆者下一步準(zhǔn)備進(jìn)行的工作。另外，本文只對(duì)P3菌進(jìn)行了初步的鑒定，目前已知其形態(tài)特征為革蘭陽(yáng)性，桿菌，產(chǎn)芽孢，好氧，有鞭毛能運(yùn)動(dòng)。后續(xù)還要通過(guò)一系列生理生化試驗(yàn)，測(cè)定16S rRNA的基因序列，以及作P3菌的系統(tǒng)發(fā)育分析，才能確證其為何種屬的細(xì)菌。

總之，本文從廚余垃圾存放處的土壤中分離得到一株耐鹽的蛋白酶高產(chǎn)菌P3，并初步進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察和半固體穿刺培養(yǎng)，為高滲條件下發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶提供了一種可能的菌種。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉國(guó)生.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2007.

[2] 代玉梅.蛋白酶高產(chǎn)菌株的篩選鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究[D].青島大學(xué)，2008.

[3] 王永紅.產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選、鑒定及水解菜粕蛋白能力[J].生物資源，2018，40（2）：135-140.

[4] 馬桂珍.高產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的分離篩選及其種類鑒定[J].食品科學(xué)，2011，32（21）：183-187.