尋崇榮，薛洪飛，江連洲，滕 飛，李 楊，隋曉楠，謝鳳英，王中江,*

（1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.濟南真諾機械有限公司，山東 濟南 250000）

肉類含有人體所需的高質量蛋白，具有良好的風味及適口性，受到廣泛青睞[1]。1961年以來，由于人口的增加，城市化、工業(yè)化、教育和收入的提高，發(fā)展中國家人均肉類消費量增長迅速，預期到2030年，肉類需求量將增加72%[2-4]。近年來，過度食用肉制品引起的公共衛(wèi)生問題，生產加工過程的土地資源、水資源消耗及CO2排放等環(huán)境問題一直是人們關注的焦點，因此利用植物資源生產高蛋白仿肉制品的研究引起了人們的廣泛關注[5-6]。

仿肉制品與某些肉類的美學性質和化學特性相似，其由非動物蛋白制成，口感、外觀及風味類似肉類[7]。由于植物蛋白仿肉制品具有較高營養(yǎng)特性及生產成本較低、價格穩(wěn)定、不易受季節(jié)性供應波動影響、保質期長、易貯存等加工貯藏特性，可作為昂貴動物源蛋白的替代品應用于食品加工工業(yè)中[8-10]。目前常用的仿肉制品原料為大豆分離蛋白、大豆?jié)饪s蛋白、脫脂豆粉、谷朊粉等，其中大豆分離蛋白及谷朊粉成分單一，常用于學術研究。谷朊粉是一種復合物，是從小麥面粉中分離出來的小麥面筋蛋白，其主要組分是麥谷蛋白和醇溶蛋白，由于其低廉的生產成本及良好的功能特性（如溶解性、黏度、膨脹性和營養(yǎng)品質）而廣泛用于仿肉制品的生產加工中[11]。楊聳[12]和Kumar[13]等的研究結果表明向大豆分離蛋白中混入適量的谷朊粉可提高仿肉制品的纖維化程度，改善產品的口感及風味，增加產品亮度及白度。

目前主要用擠壓、凍結、紡絲黏結和水蒸氣膨化等方法制備仿肉制品，其中擠壓法應用廣泛，其可大規(guī)模連續(xù)化生產，操作便利、不產生廢料、產品質地均勻[14]。而高濕擠壓技術（物料水分質量分數≥40%）是國際上新興的植物蛋白重組技術，得到的產品質地與肉類相似，不需復水即可直接食用，營養(yǎng)成分和生理活性成分損失少，但得到的產品風味較差，豆腥味嚴重，需對擠壓物料進行調味，以改善產品的感官可接受度[15]。Menis等[16]探討了低水分含量擠壓條件對玉米糝擠壓物結構及風味物質異戊酸、丁酸乙酯和丁酸保留率的影響，結果發(fā)現擠壓參數會影響擠出物的感官可接受度，且高溫高轉速及低溫低轉速下，擠出物的感官可接受度較高。Yuliani等[17-18]分別利用酪蛋白酸鈉和β-環(huán)糊精微膠囊技術包埋風味物質檸檬烯，以玉米淀粉為擠壓原料進行低水分含量擠壓，結果發(fā)現檸檬烯的保留率受擠壓條件的影響較大，較低溫度下，提高螺桿轉速導致風味物質保留率下降。鄭雅丹[14]、劉毅[19]的研究結果表明，適度增加螺桿轉速可降低高濕擠壓亞麻糊的彈性模量，提高物料在機筒中受到的摩擦力及剪切力，增加擠出物彈性、組織化度、持水率等，改變擠出物的水分分布及微觀結構。上述研究表明擠壓產品的揮發(fā)性風味物質保留率可能與擠壓螺桿轉速有關，且螺桿轉速的變化可能影響擠壓樣品的微觀結構、水分分布等結構特性[19-20]。

目前對低水分含量擠壓產品風味物質保留率的研究較多，對高濕擠壓產品揮發(fā)性風味物質保留率的研究尚鮮見報道。本實驗利用高濕擠壓技術制備植物蛋白仿肉制品，以大豆分離蛋白為主要擠壓原料，天然呈味粉末油脂為香氣調味料，確定螺桿轉速對擠出物微觀結構、水分分布、蛋白結構及揮發(fā)性風味物質保留率的影響，以期為持香型仿肉制品的生產加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（蛋白質量分數98%） 山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；谷朊粉 鄭州天龍生物科技有限公司；天然呈味粉末（成分：香辛料風味提取物、β-環(huán)狀糊精） 廣州市晨益貿易有限公司；實驗所需基礎試劑均為分析純 北京化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

拌粉機 濟南德倫機械設備有限公司；FT-36型雙螺桿擠壓機 濟南真諾機械有限公司；DZ型真空包裝機萬昌隆包裝機電有限公司；7890 A-5975 C氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司；CTC頂空進樣針（5 mL）瑞士Hamilton公司；FD 5-series冷凍干燥機 美國SP科學公司；5570型掃描電子顯微鏡、8400 S傅里葉變換紅外光譜儀 日本日立公司；mq 20-核磁共振分析儀德國Bruker公司；AL 204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 持香型仿肉制品的制備

拌料→參數調節(jié)→喂料→高濕擠壓→真空密封→冷藏

準確稱取1 kg大豆分離蛋白于拌粉機中，加入大豆分離蛋白質量10%的谷朊粉和1%（占大豆分離蛋白和谷朊粉總質量的百分比）的天然呈味粉末，在拌粉機中混合20 min，混合的同時于注水口添加60%（占總物料質量的百分比）的去離子水；調節(jié)擠壓機喂料速率30 g/min，螺桿轉速分別為200、250、300、350 r/min，擠壓筒各加熱區(qū)段溫度：1區(qū)（喂料區(qū)）為20 ℃，2～5區(qū)（加熱區(qū)）依次為80、100、120、150 ℃，6區(qū)和7區(qū)為冷卻段，監(jiān)控溫度為60～80 ℃；將拌好的物料分批加入喂料桶，進行擠壓，擠出樣品立即密封并于4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆肹10]。

1.3.2 頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用分析

參照葉韜等[21]的研究方法，萃取頭于氣相色譜儀進樣口活化1 h（270 ℃），分別精確稱取2.0 g切割為2 mm左右的樣品及擠壓原料于自動進樣瓶中，加入1 μL的2,4,6-三甲基吡啶（2,4,6-trimethylpyridine，TMP）標準品，密封，插入自動頂空進樣器，調節(jié)溫度為90 ℃，解吸3 min。色譜條件：色譜柱DB-5 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），柱流量1 mL/min，進口溫度250 ℃，調節(jié)起始溫度為40 ℃，停留2 min；升溫速率6 ℃/min，升至120 ℃，停留5 min；升溫速率8 ℃/min，升至200 ℃，停留2 min；升溫速率10 ℃/min，升至250 ℃，停留8 min。質譜條件：接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電離方式為電子電離，電子能量70 eV，質量掃描范圍45～450 amu/s。以匹配度大于80的化合物進行質譜定性，以揮發(fā)性風味物質的峰面積與TMP峰面積的比值進行定量，擠壓樣品中各揮發(fā)性物質保留率按下式計算。

1.3.3 掃描電子顯微鏡觀察

參照孫志欣[22]的方法，將仿肉樣品切片（厚1 mm、寬4 mm、長4 mm），用體積分數2.5%、pH 6.8的戊二醛固定（4 ℃、1.5 h），0.l mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液沖洗（2 次、10 min/次），體積分數50%、70%、90%乙醇溶液各脫水10 min，100%乙醇脫水兩次（每次10 min），100%乙醇與叔丁醇混合溶液（1∶1，V/V）脫水15 min，叔丁醇脫水15 min（室溫高于25 ℃下操作），冷凍干燥4 h，樣品觀察面向上粘于掃描電子顯微鏡樣品臺，鍍金（厚度1 500 nm），將鍍金后的樣品放入掃描電子顯微鏡觀察（放大倍數為500）。

1.3.4 核磁共振分析

將擠壓樣品切條置于直徑25 mm的核磁管中（布滿至核磁管高度的1/3處，盡量不留空隙），參照李騰[23]的掃描參數，用CPMG序列測量橫向弛豫時間T2，各樣品重復測量3 次，保存數據，記錄T2b、T21和T22。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜分析

參考和陳鋒亮[15]Beck[24]等的研究方法，將真空冷凍干燥的樣品粉碎，在紅外燈下研磨后取樣（2 mg），并混入200 mg溴化鉀純品于瑪瑙研缽中，研磨約15 min后進行壓片（壓力14 kg、時間1 min），將樣品片放入傅里葉變換紅外光譜儀中掃描。掃描條件：光譜掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，信號掃描累加64 次。利用分峰軟件PeakFit 4.0進行圖譜處理。

1.4 數據處理與分析

每組實驗都進行3 次平行，并將實驗數據進行誤差分析。采用統計學軟件SPSS 18對實驗數據進行相關性（Pearson相關系數法）和顯著性分析（方差分析，P＜0.05為差異顯著）；采用Origin 8.5軟件進行作圖；數據及方差分析利用Design-Expert軟件進行。

2 結果與分析

2.1 仿肉制品各揮發(fā)性風味物質保留率分析

表1 螺桿轉速對仿肉制品揮發(fā)性風味物質保留率的影響Table 1 Effect of screw rotation speed on the retention rate of volatile fl avor substances in meat analogues

由表1可知，仿肉制品中各揮發(fā)性風味物質的總保留率及烯類、酚類、醛類、醇類、酯類及烷烴類的揮發(fā)性風味物質保留率隨螺桿轉速的增加均有先增多后減少的變化趨勢，且在300 r/min時最大。上述保留率變化的原因可能與擠壓過程中蛋白結構變化有關，一定程度上增加螺桿轉速，導致擠壓過程中蛋白對部分揮發(fā)性風味物質的吸附能力增強，在仿肉制品擠出時，受水分蒸發(fā)影響較小，導致保留率較大[19,25]；而隨著螺桿轉速的繼續(xù)增加，物料在機筒的滯留時間縮短，與蛋白的吸附時間相應縮短，且較高的轉速也可能破壞β-環(huán)狀糊精膠囊，導致更多的風味物質流出，在物料擠出時，隨擠出物中部分水分的蒸發(fā)而損失，導致其保留率較低[18]。不同揮發(fā)性風味物質的保留率有較大差異，保留率最高達到92.88%（茴香腦），最低為0（3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、桉樹醇），而與其他類型相比，醇類及醛類的保留率相對較小，原因可能與風味物質的物理化學特性有關，擠壓過程中蛋白與其結合，檢測過程中風味無法釋放，導致保留率較小[26]。其中3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、桉樹醇的保留率較?。ㄗ畹蜑?%），原因可能是原料中這兩種揮發(fā)性風味物質含量較少，且在擠壓過程中損失嚴重，導致剩余含量較少而難以檢測到。

2.2 大豆分離蛋白仿肉制品顯微結構觀察結果

圖1 螺桿轉速對仿肉制品顯微結構（縱截面）的影響Fig. 1 Effect of screw rotation speed on the longitudinal microstructure of meat analogues

圖2 螺桿轉速對仿肉制品顯微結構（橫截面）的影響Fig. 2 Effect of screw speed on the cross-sectional microstructure of meat analogues

由圖1、2可知，螺桿轉速對仿肉制品的微觀結構影響較大，200～250 r/min時，仿肉制品的微觀結構較緊密，增加至300 r/min時，仿肉制品內部出現斷裂現象，繼續(xù)增加螺桿轉速，仿肉制品內部出現空洞。上述微觀結構的變化可能與物料在擠壓過程中化學鍵變化及蛋白二級結構變化有關，螺桿轉速增加，增強了螺桿對物料的剪切力及物料與機筒的摩擦力，蛋白在擠壓過程中變性程度增加，黏性降低，在高強度剪切力下，內部出現斷裂現象[20]，且轉速過高，物料在擠出時部分膨化，產生管狀氣腔結構[14,27]，出現圖1d和圖2d中的空洞。

2.3 仿肉制品弛豫時間（T2）分析結果

圖3 不同螺桿轉速的仿肉制品T2弛豫曲線Fig. 3 T2 relaxation time distribution curves of meat analogues at different screw rotation speeds

表2 螺桿轉速對仿肉制品T2的影響Table 2 Effect of screw rotation speed on T2 relaxation time of meat analogues

由圖3及表2可知，隨螺桿轉速的增加，仿肉制品T2b先增大后減小，250 r/min時，T2b最大。由Bosmans[28]和Li Teng[29]等的研究結果可知，弛豫時間短于1 ms的組分主要為蛋白質等大分子物質中不可交換的CH質子，其埋藏于分子內部，較難接觸外部水分子，自由度較低；而上述結果變化的原因可能是螺桿轉速的提高，增加了擠壓物料的混合速度，促進熱量傳遞并形成較多摩擦熱，導致蛋白在擠壓過程中變性嚴重，損失部分CH質子，減弱蛋白內部與水分子間的相互作用，導致T2b增大[20]。而繼續(xù)增加螺桿轉速，較高的剪切力可能促進水分進入蛋白內部，增強蛋白與水分子間的相互作用，水分子運動自由度降低，導致T2b減小[23,30]。

由表2中T21的變化趨勢可知，隨螺桿轉速的增加，T21有先增大后減小的變化趨勢，且250 r/min時，其仿肉制品T21有最大值4.76 ms。由Ruan等[30]的研究結果可知，T21對應水分在仿肉制品中大分子間轉移和水分子與蛋白大分子間氫鍵變化的弛豫時間，結合上述結果說明，一定程度上加快螺桿轉速可增加水分子的運動性，原因可能是螺桿轉速增加，蛋白變性程度增強，內部疏水基團較親水基團暴露更多，疏水作用較強（可能影響部分揮發(fā)性風味物質的吸附[19]），導致水分子間的相互作用較蛋白與水分子間的強烈，水分轉移更自由，T21增大；而繼續(xù)加快螺桿轉速，親水基團暴露較多，蛋白與水分子間形成氫鍵，導致水分轉移較困難，T21減小[14,24]。

由表2中T22的變化趨勢可知，螺桿轉速由200 r/min增加到250 r/min時，T22不變；由250 r/min增加到300 r/min時，T22增大，且繼續(xù)增加螺桿轉速，T22不變。推測T22對應的主要為仿肉制品內部較大空隙及裂縫中的水分子運動弛豫時間，該部分水分子運動自由度高，對應T22值較大[24]。結合2.2節(jié)顯微結構分析可知，螺桿轉速增加300 r/min，物料在擠出時受到的剪切強度增大，仿肉制品內部出現斷裂及膨化現象，T22對應水分轉移較自由，導致T22增大。

2.4 大豆分離蛋白仿肉制品蛋白質二級結構分析

由圖4可知，與擠壓原料相比，仿肉制品在3 300～3 500 cm-1范圍O—H及N—H鍵的伸縮振動吸收總體減弱，但隨著螺桿轉速的增加變化不規(guī)律，其中在300 r/min時的振動吸收最強，且比原料的振動吸收強，說明蛋白質與水分子的O-H基團、氨基酸的C＝O基團之間分子內、分子間氫鍵較強，推測該結果與部分親水基團形成氫鍵有關[25,31]。而與擠壓原料相比，仿肉制品在2 200～2 400 cm-1范圍伸縮振動吸收增強，且隨著螺桿轉速的增加，振動吸收先增強后減弱，其中在250 r/min的振動吸收最強，該部分主要是—CH2變形振動及C—H鍵伸縮振動，其吸收峰強度的變化可能與氫鍵的形成及蛋白與某些風味成分的結合有關[32]。1 600～1 700 cm-1范圍稱為酰胺I帶，由該波長范圍通過PeakFit 4.0軟件進行基線校正、去卷積、二階導數擬合[33]，得到各二級結構相對含量（表2）。其中β1為β-反向平行折疊片層，由分子間強相互作用氫鍵維持；β2由分子間非平面弱氫鍵維持；β-折疊及α-螺旋由分子內相互作用氫鍵維持；β-轉角為松散有序結構，含量最高；γ-無規(guī)卷曲由C＝O與水形成的氫鍵維持[34-35]。

圖4 不同螺桿轉速仿肉制品的紅外光譜圖Fig. 4 Infrared spectra of meat analogues at different screw rotation speeds

表3 不同螺桿轉速仿肉制品蛋白質二級結構的相對含量Table 3 Relative percentage of protein secondary structures in meat analogues at different screw rotation speeds

由表3可知，仿肉制品主要由松散有序結構（β-轉角，相對含量約25%）與緊密有序結構（α-螺旋+β-折疊，40%左右）組成，α-螺旋+β-折疊相對含量較β1+β2高，說明仿肉制品分子內氫鍵相互作用較強[34]。隨螺桿轉速的增加，仿肉制品中β1和β2相對含量先增加后減少，各擠壓處理組β1相對較擠壓原料少，其中在250 r/min時，β1和β2相對含量最高，且β2較擠壓原料相對含量高；由劉燕琪等[34]的研究表明β1由分子間親水側鏈強氫鍵維持，其相對含量較高，可能蛋白親水基團含量較多，蛋白親水水合作用較強，β2由分子間非平面弱氫鍵維持，上述結果說明在一定程度上增加螺桿轉速，可增加仿肉制品的分子間弱氫鍵含量。β1+β2二級結構相對含量主要表征蛋白分子間氫鍵作用，由表3可知，β1+β2相對含量隨螺桿轉速的增加先增加后減少，且在250 r/min時含量最高，表明在該轉速下，仿肉制品中分子間氫鍵作用最強，蛋白聚集增多，導致蛋白結構更為緊密，可能利于對部分揮發(fā)性風味物質的保持[26]。β-轉角的相對含量隨螺桿轉速的增加而增多，α-螺旋+β-折疊相對含量呈先減少后增多的變化趨勢，且在300 r/min時的相對含量最少，說明在一定程度上螺桿轉速的增加，可減少仿肉制品中緊密有序結構的含量，增加松散有序結構，有利于蛋白在擠壓過程中的結構變化，易于形成纖維狀仿肉制品及部分揮發(fā)性風味物質的吸附[19,36]。γ-無規(guī)卷曲相對含量隨螺桿轉速的增加有先增多后減少的變化趨勢，且在300 r/min時最多，可能與β1、β2向γ-無規(guī)卷曲結構轉變有關，說明在一定程度上增加螺桿轉速，C＝O與水分子的氫鍵作用增強，進而影響T2b的變化趨勢；且由王辰等[37]的研究可知γ-無規(guī)卷曲含量與表面疏水性呈正相關，說明在一定程度上增加螺桿轉速，可能引起擠壓過程中部分疏水基團暴露，增強疏水相互作用及疏水水合作用，可能導致擠壓過程中蛋白對風味物質的吸附力增強，繼而提高揮發(fā)性風味物質的保留率[36]。

3 結 論

本實驗研究了螺桿轉速對持香型大豆分離蛋白仿肉制品微觀結構、水分分布、揮發(fā)性風味物質保留率的影響。結果表明一定程度上增加螺桿轉速，可產生較為緊密的仿肉制品微觀結構，減弱水分子的運動自由度，減少α-螺旋和β-折疊緊密結構的相對含量，使蛋白二級結構展開，上述結構變化有利于揮發(fā)性風味物質的保持，原因可能是緊密的仿肉制品結構導致風味物質擴散速度減慢；水分子運動自由度減弱可側面反映風味物質的擴散速率，其自由度低，風味擴散較慢；另外二級結構的展開（柔性增加）、蛋白氫鍵及疏水基團的增多可能促進部分風味物質與蛋白發(fā)生可逆性結合，在頂空氣相色譜-質譜分析過程中升溫導致這部分風味物質釋放，造成風味物質保留量增多。