劉金宜，富煒琦，杜冠華，王金華，楊 淬

( 1. 云南民族大學民族醫(yī)藥學院,民族藥資源化學國家民委教育部重點實驗室, 云南 昆明 650500;2. 中國醫(yī)學科學院藥物研究所,藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室, 北京 100050)

腫瘤是一類嚴重威脅人類健康的疾病。據(jù)我國2018年最新癌癥報告顯示，2014年全國惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)380.4萬例，0～74歲累積死亡率為12.00%。腫瘤是多因素經(jīng)過多個過程形成的，包括腫瘤的起始、發(fā)展、浸潤、轉移等[1-2]。目前，腫瘤的靶向治療已成為腫瘤治療的研究熱點。與傳統(tǒng)細胞毒化療不同，腫瘤分子靶向治療具有特異性抗腫瘤作用，并且毒性明顯減少，開創(chuàng)了腫瘤治療的新領域[3]。

在惡性腫瘤中，黑色素瘤是皮膚腫瘤中惡性程度最高的一種，具有容易出現(xiàn)遠處轉移、增長快、死亡率高、預后差的特點。因此，闡明黑色素瘤的分子機制，發(fā)現(xiàn)新的黑色素瘤治療靶標及基于這些靶標的新藥發(fā)現(xiàn)，對于黑色素瘤的治療具有重要的意義[4]。

ST8α-N-乙?；?神經(jīng)氨酸α-2,8-唾液酸轉移酶1(ST8 alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 1,ST8Sia1)是唾液酸轉移酶ST8Sia亞家族的6個成員(ST8Sia I-VI)之一，又被稱為神經(jīng)節(jié)苷脂3合成酶(ganglioside GD3 synthase, GD3s)。ST8Sia1是神經(jīng)節(jié)苷脂GD3和神經(jīng)節(jié)苷脂GD2生物合成的唯一關鍵酶[5-6]。ST8Sia1的功能研究，對于GD3及其下游產(chǎn)物的生物合成以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等，具有重要的意義。已有文獻報道，ST8Sia1在腫瘤中高表達，特別是在神經(jīng)外胚層來源的腫瘤中表達很高，如惡性膠質瘤、黑色素瘤等[7]。我們通過生物信息學分析，也發(fā)現(xiàn)了ST8Sia1在黑色素瘤中的高表達，但是ST8Sia1能否作為抗腫瘤靶點仍不確定。為了研究ST8Sia1在黑色素瘤中的功能及其作用機制，構建高表達ST8Sia1基因的表達載體顯得非常重要。本研究主要利用基因工程技術，構建了兩種不同的ST8Sia1基因過表達載體，并比較了不同載體在人黑色素瘤細胞WM451中的轉染效率，挑選轉染效率較高的載體，建立穩(wěn)定高表達ST8Sia1的細胞株，并探討ST8Sia1過表達對黑色素瘤細胞增殖的影響。本研究為進一步研究ST8Sia1基因在黑色素瘤中的生物學功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人胚胎腎細胞293T購自中國科學院細胞庫(上海)；人黑色素瘤細胞WM451購自廣州吉妮歐公司。

1.1.2試劑 ST8Sia1-myc-flag質粒，購自美國Origene公司(CAT # : RC223851)； pEGFP-C1載體，購自上海唯地生物公司；pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-Puro載體，購自漢恒生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I、Bgl II、BamH I、Xba I，購自日本TaKaRa公司；DNA ladder購自美國Thermo Fisher Scientific公司；大腸桿菌菌株DH5α，購自美國Invitrogen公司；質粒DNA小、大量抽提試劑盒，購自北京康為世紀公司；凝膠回收試劑盒，購自上海捷瑞生物工程有限公司；瓊脂糖、瓊脂粉，購自上海生工生物工程有限公司；KOD-Plus Kit購自上海東洋紡生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)，購自美國Invitrogen公司；ST8Sia1多克隆抗體購自Abcam公司(CAT # : ab37806)；GAPDH鼠單克隆抗體購自Proteintech公司(CAT # : 60004-1-Ig)。ST8Sia1引物由奧科鼎盛生物科技有限公司合成；堿基測序由睿博興科測序公司完成。

1.1.3儀器 熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；CXY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)；細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Tanon-1200凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1不同ST8Sia1基因過表達載體構建

1.2.1.1構建攜帶綠色熒光蛋白的ST8Sia1-pEGFP-C1重組質粒 引物設計。從GenBank 庫中查找人ST8Sia1的mRNA序列，設計引物。h-ST8Sia1-forward primer: GAGAAG ATCTatgagcccctgcgggcgg；h-ST8Sia1-reverse primer: GCTCTA GATCAggaagtgggctggagtgaggta。

ST8Sia1片段PCR回收。PCR擴增ST8Sia1序列，體系(50 μL)為：10×PCR Buffer for KOD plus 5 μL, MgSO4(25 mmol·L-1) 3 μL, dNTPs (2 mmol·L-1) 5 μL, 上游引物(10 μmol·L-1) 1.5 μL，下游引物(10 μmol·L-1) 1.5 μL，KOD plus DNA polymerase 1 μL，模板DNA(ST8Sia1質粒，100 ng· μL-1)1 μL, ddH2O 32 μL。將以上反應物輕輕混勻后進入擴增程序，即94 ℃ 2 min,然后反復98 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 68 ℃ 45 s循環(huán)30次,68 ℃ 10 min，4 ℃冷卻后取出，瓊脂糖凝膠回收目的條帶,大小約1 100 bp,獲得ST8Sia1 cDNA片段。

ST8Sia1PCR產(chǎn)物、pEGFP-C1 載體雙酶切及連接。ST8Sia1的PCR產(chǎn)物進行 Bgl II/Xba I 的雙酶切,體系(50 μL)為：ST8Sia1膠回收產(chǎn)物33 μL，Bgl II 1 μL，Xba I 1 μL，10×T buffer 10 μL，ddH2O 5 μL，37 ℃水浴消化過夜,進行膠回收電泳及膠回收純化,得到帶有Bgl II/Xba I黏性末端的ST8Sia1序列。pEGFP-C1 載體雙酶切，體系(50 μL)為：pEGFP-C1質粒3 μL (約1.5 μg) ，Bgl II 1 μL，Xba I 1 μL，10×T buffer 10 μL，ddH2O 35 μL，37 ℃水浴消化5 h,進行膠回收電泳切膠并回收 4 731 bp 的條帶,得到帶有Bgl II/Xba I黏性末端的線性化pEGFP-C1載體。連接目的基因ST8Sia1和載體pEGFP-C1,連接體系(8 μL)為：膠回收的ST8Sia1 DNA 3 μL，膠回收的 pEGFP-C1 plasmid 1 μL，DNA Ligation Kit Solution I 4 μL，16 ℃水浴5 h，獲得連接產(chǎn)物。

連接產(chǎn)物轉化及陽性克隆鑒定。取上述連接產(chǎn)物8 μL，加入30 μL DH5α感受態(tài)細胞，冰上放置30 min，42 ℃水浴中熱激90 s,然后迅速置于冰上冷卻5 min。向管中加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，混勻后，于37 ℃、220 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)1 h。離心，去除900 μL上清,余下培養(yǎng)基吸打混勻后，涂布于含卡那霉素的固體培養(yǎng)基平板。倒置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過夜。挑取單個菌落接種于含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)。抽提質粒, PCR方法進行鑒定,產(chǎn)生1 068 bp 左右條帶的為陽性,對其進行 DNA 序列測定。

1.2.1.2構建攜帶綠色熒光蛋白的ST8Sia1過表達慢病毒載體 引物設計，從GenBank 庫中查找人ST8Sia1的mRNA序列，設計引物。h-ST8Sia1-Eco/Eco-forward primer: ggatctatttccggtGaattcgccaccATGAGCCCCTGCGGGCGG; h-ST8Sia1-Xho/Eco-reverse primer: tctagaactagtctcgagGGAAGTGGGCTGG AGTGAGGTATCT。

ST8Sia1片段PCR回收：同“1.2.1.1”。

pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-Puro載體酶切后，與ST8Sia1目的片段重組。用pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-Puro作為載體，目的片段插入 MCS 區(qū),由 CMV 啟動子調(diào)控表達。載體用EcoRI 酶切，體系(40 μL)為：載體(400 ng·μL-1) 2 μL，EcoRI 2 μL，10× Buffer 4 μL，H2O 32 μL。將以上反應物緩慢混合后，置于37 ℃恒溫水浴鍋中2 h，獲得酶切后的pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-Puro載體。將“1.2.1.1”中處理好的ST8Sia1基因片段與載體連接，反應體系(20 μL)為：片段50 ng, 酶切后載體20 ng, HB-infusion Master Mix (2×) 10 μL, 超純H2O加至總體系為20 μL。以上反應體系置于50 ℃水浴20 min，獲得連接產(chǎn)物。

連接產(chǎn)物轉化及陽性克隆鑒定。取上述連接產(chǎn)物10 μL到30 μL DH5α感受態(tài)細胞中,涂布含氨芐西林的固體培養(yǎng)基平板,37 ℃培養(yǎng)過夜,挑取單個菌落接種于含氨芐西林的液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)。菌液進行PCR鑒定，將陽性克隆菌液送測序公司測序。

重組慢病毒的包裝及滴度檢測。對陽性克隆菌液進行高純度無內(nèi)毒素質粒抽提，得到慢病毒載體質粒，將重組質粒載體和兩個包裝質粒(pMD2.G和psPAX2) 混合后，共轉染293T細胞，培養(yǎng)72 h后，收集細胞上清液，0.45 μm濾器過濾，離心濃縮，得到高滴度的病毒濃縮液。采用稀釋計數(shù)法測定各組病毒滴度。將293T細胞按2×103每孔接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h后，將慢病毒原液以3倍稀釋成6個梯度，加入對應的96孔板中。24 h后更換培養(yǎng)基，定期觀察。48 h后在熒光顯微鏡下觀察結果，熒光百分比在10%～30%的孔計算病毒滴度。

1.2.2不同ST8Sia1基因過表達載體轉染黑色素瘤WM451細胞 用ST8Sia1低表達的黑色素瘤WM451細胞作為轉染細胞株，分別用ST8Sia1-pEGFP-C1重組質粒和ST8Sia1過表達慢病毒載體對細胞進行轉染，并用熒光顯微鏡觀察轉染效率。

1.2.2.1ST8Sia1-pEGFP-C1重組質粒轉染W(wǎng)M451細胞 實驗分為2組：① 陰性對照組(NC)：WM451細胞轉染pEGFP-C1空載體對照質粒；② ST8Sia1-pEGFP-C1重組質粒組：WM451細胞轉染ST8Sia1-pEGFP-C1重組質粒。細胞鋪6孔板24 h后，按照Lipofectamine 3000說明書對其進行轉染。轉染48 h后，熒光顯微鏡下觀察其綠色熒光的表達情況。

1.2.2.2ST8Sia1過表達慢病毒載體感染W(wǎng)M451細胞 實驗分為3組：① 空白對照組：WM451細胞正常培養(yǎng)；② 陰性對照組(NC)：WM451細胞感染空慢病毒載體；③ ST8Sia1過表達慢病毒載體組：WM451細胞感染ST8Sia1過表達慢病毒載體。細胞鋪6孔板24 h后，吸去細胞原有培養(yǎng)基，加入1.5 mL含有5 mg·L-1聚凝胺的新鮮培養(yǎng)基，再分別吸取病毒原液加入相應的組中，4 h后補齊培養(yǎng)基至正常體積。感染24 h后，吸去含病毒的培養(yǎng)液， 換上新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)。48 h后，熒光顯微鏡下觀察其綠色熒光的表達情況。加入嘌呤霉素進行篩選,每48 h更換含嘌呤霉素的培養(yǎng)基,至未被感染的細胞被嘌呤霉素殺光。繼續(xù)加嘌呤霉素進行維持性篩選培養(yǎng)，連續(xù)篩選并傳3代后，得到穩(wěn)轉細胞株WM451-NC、WM451- ST8Sia1。

1.2.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測ST8Sia1 mRNA 的表達水平 將穩(wěn)轉細胞株WM451-NC、WM451- ST8Sia1分別接種于6 cm中皿培養(yǎng)24 h后，用TRIzol法提取總RNA，并測定RNA濃度和純度。用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，qRT-PCR檢測細胞內(nèi)ST8Sia1 mRNA表達水平，內(nèi)參為GAPDH。反應體系(25 μL)為：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL, 正向引物1 μL (10 μmol·L-1)，反向引物1 μL (10 μmol·L-1)，模板DNA 2 μL，超純H2O 8.5 μL。將以上反應物輕輕混勻后進入擴增程序，采用兩步法qRT-PCR反應程序: 95 ℃ 30 s; 然后反復95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s循環(huán)40次。熔解曲線分析為95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s。采用相對定量法分析ST8Sia1的相對表達量,以Folds=2-ΔΔCT表示待測組與對照組目的基因表達量的倍比關系。

1.2.4Western blot檢測ST8Sia1蛋白的表達水平 將穩(wěn)轉細胞株WM451-NC(normal control)、WM451-ST8Sia1分別接種于6 cm中皿培養(yǎng)24 h后，提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度。取等量蛋白(20 μg)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，濕法轉膜，10%脫脂牛奶搖床封閉1 h，剪膜。分別將含有目的蛋白ST8Sia1(47 ku)和內(nèi)參蛋白GAPDH(36 ku)的PVDF膜放于相應的抗體中，4 ℃孵育過夜。TBST漂洗后，加入辣根過氧化物酶標記的IgG二抗室溫孵育1 h。TBST漂洗，化學發(fā)光顯影并拍照。

1.2.5CCK-8法檢測ST8Sia1過表達后細胞增殖 分別將WM451-NC、WM451- ST8Sia1細胞以3×103每孔的密度種于96孔板中，待細胞貼壁后作為0 h，每孔加入含有10 μL CCK-8的培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)箱孵育1 h后，檢測每孔在450 nm波長處的吸光度,連續(xù)檢測4 d(24、48、72、96 h), 并繪制細胞生長曲線。

1.2.6軟瓊脂糖法檢測ST8Sia1過表達后細胞克隆形成能力 配制0.7%軟瓊脂,以每孔2 mL的量鋪于6孔板，靜置5 min，待其凝固。配制含有相應細胞懸液(3 000個左右)的0.35%軟瓊脂，以每孔1.5 mL的量鋪于6孔板。4 ℃冰箱靜置1～2 h凝固后，放入37 ℃培養(yǎng)箱，3～4周觀察細胞克隆。

2 結果

2.1 不同ST8Sia1過表達載體的構建及鑒定構建ST8Sia1-pEGFP-C1重組質粒，進行PCR鑒定(Fig 1A)，并送測序公司測序(Fig 1B)，結果表明ST8Sia1-pEGFP-C1重組質粒構建成功。構建ST8Sia1過表達慢病毒，進行PCR鑒定(Fig 2A)，并送測序公司測序(Fig 2B)，結果表明ST8Sia1過表達慢病毒構建成功。

2.2 慢病毒包裝及病毒滴度測定重組質粒載體和包裝質粒共轉染293T細胞，48 h后細胞出現(xiàn)融合現(xiàn)象，用熒光顯微鏡可觀察到較強的綠色熒光，說明病毒包裝成功。將病毒濃縮液梯度稀釋后加入293T細胞，48 h后熒光顯微鏡下觀察(Fig 3)，熒光百分比在10%～30%的孔計算病毒滴度。滴度計算：對照組滴度=4×104×10%×感染復數(shù)(1)×病毒稀釋倍數(shù)(30)×103=1×1011TU·L-1；ST8Sia1滴度=4×104×10%×感染復數(shù)(1)×病毒稀釋倍數(shù)(30) ×103=1×1011TU·L-1。

2.3 不同ST8Sia1過表達載體轉染W(wǎng)M451細胞轉染效率不同ST8Sia1過表達載體轉染W(wǎng)M451細胞48 h，在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達。結果顯示，ST8Sia1-pEGFP-C1過表達質粒組的綠色熒光蛋白表達水平遠遠低于慢病毒載體組(Fig 4)，說明慢病毒載體的轉染效率遠高于ST8Sia1-pEGFP-C1過表達質粒。因此，選擇ST8Sia1過表達慢病毒載體進行細胞轉染實驗。轉染48 h后，加入嘌呤霉素進行篩選，得到穩(wěn)定細胞株WM451-NC、WM451- ST8Sia1。

Fig 1 Identification results of ST8Sia1-pEGFP-C1

A: The PCR identification results of ST8Sia1-pEGFP-C1; B: The monoclonal sequencing results of ST8Sia1-pEGFP-C1 recombinant vector.

Fig 2 Identification results of ST8Sia1 over-expression lentiviral vector

A: The PCR identification results of ST8Sia1 over-expression lentiviral vector; B: The monoclonal sequencing results of ST8Sia1 over-expression lentiviral vector.

Fig 3 Calculation of ST8Sia1 over-expression lentivirus titer

A: Expression of green fluorescent protein in 293T cells infected with different gradient dilution of empty lentivirus for 48 h; B: Expression of green fluorescent protein in 293T cells infected with different gradient dilution of ST8Sia1 overexpressed lentivirus for 48 h.

Fig 4 Different ST8Sia1 over-expression vectors transfected into WM451 cells

2.4 過表達慢病毒感染后WM451細胞ST8Sia1 mRNA相對表達水平Fig 5的qRT-PCR結果顯示，與空慢病毒載體組(NC)相比，ST8Sia1過表達慢病毒感染后，ST8Sia1 mRNA表達量明顯提高(P<0.01)。另外,qRT-PCR 的熔解曲線分析結果顯示, ST8Sia1擴增產(chǎn)物的特異性良好,40個擴增循環(huán)中沒有引物二聚體的產(chǎn)生。

2.5 過表達慢病毒感染后WM451細胞ST8Sia1 蛋白表達水平Fig 6的Western blot結果顯示，與空慢病毒載體組(NC)相比，ST8Sia1過表達慢病毒感染后，ST8Sia1 蛋白表達量明顯提高(P<0.05)。

2.6 過表達慢病毒感染后WM451細胞增殖情況CCK-8法檢測ST8Sia1過表達后細胞增殖水平。結果表明，穩(wěn)定過表達ST8Sia1的WM451細胞增殖速度明顯高于正常對照(Fig 7)。說明ST8Sia1過表達可促進WM451細胞的增殖。

Fig 5 Relative level of ST8Sia1 mRNA in WM451- NC cells and

**P<0.01vsNC group

Fig 6 Expression level ST8Sia1 protein in WM451- NC cells and

*P<0.05vsNC group

2.7 過表達慢病毒感染后WM451細胞克隆形成能力軟瓊脂糖法檢測ST8Sia1過表達后細胞克隆形成能力。結果表明，與空白載體相比，穩(wěn)定過表達ST8Sia1的WM451細胞克隆形成能力明顯增加(Fig 8)，說明ST8Sia1過表達可促進WM451細胞的克隆形成能力。

3 討論

目前，在細胞中基因過表達的載體包括非病毒載體和病毒載體,病毒載體又包括慢病毒、腺病毒、逆轉錄病毒等。在此研究中，我們成功構建了兩個新的普通質粒載體和慢病毒載體，并對它們的轉染效率進行對比，發(fā)現(xiàn)慢病毒載體的轉染效率遠遠高于普通質粒。因此，本研究選擇ST8Sia1過表達慢病毒載體，進一步建立穩(wěn)定轉染ST8Sia1基因的細胞系。在20世紀90年代中期，各種病毒載體開始被應用于細胞轉染。其中，慢病毒是以人類免疫缺陷型病毒(human immunodeficiency virus，HIV)為基礎發(fā)展的基因治療載體，與其他類型的病毒相比，慢病毒能夠感染并整合到一些不分裂的細胞中，如巨噬細胞[8]。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。同時，慢病毒載體還具有安全性高的特點，并且能夠有效感染多種細胞[9-10]。因此，利用慢病毒載體建立穩(wěn)定高表達ST8Sia1的細胞株，為進一步研究ST8Sia1基因在腫瘤中的生物學功能奠定了基礎。

Fig 7 Proliferation curve of WM451-NC cells and

*P<0.05vsNC group

Fig 8 Clony formation of WM451-NC cells and WM451- ST8Sia1 cells in soft agar

ST8Sia1也被稱為GD3s[5-6]。已有文獻報道，GD3s在腫瘤中高表達。Yamashiro等[7]研究了GD3s在不同腫瘤細胞株的表達水平，發(fā)現(xiàn)GD3s在黑色素瘤細胞、成神經(jīng)細胞瘤和膠質瘤中高表達。GD3s在雌激素受體陰性乳腺癌和三陰性乳腺癌中也高表達[11]。研究表明，GD3s 不僅可以通過調(diào)節(jié)GD3和GD2，促進腫瘤的發(fā)展,還可以通過多種機制，直接促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和遷移。Battula等[12]研究發(fā)現(xiàn)，GD3s能夠調(diào)節(jié)上皮-間質轉化,從而促進乳腺癌細胞的侵襲和轉移。抑制GD3s的表達可以降低乳腺癌干細胞的增殖，同時抑制其干細胞特性。Cazet等[13]發(fā)現(xiàn)，GD3s過表達可以誘導GD2和GD3在乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞表面的累積，并且通過激活c-Met，進一步激活下游的MEK/ERK和PI3K/Akt信號通路，促進腫瘤細胞的增殖。GD3s還可以刺激黑色素瘤細胞增殖[14]。在黑色素瘤細胞SK-MEL-2中，NF-κB可以調(diào)控GD3s的轉錄活性，進而影響GD3的表達，起到腫瘤抑制的作用[15]。盡管對GD3s的功能和機制研究有一定的進展，但確切的機制仍不清楚。

本研究成功構建過表達ST8Sia1基因的兩個不同載體，并對比不同載體在人黑色素瘤細胞WM451中的轉染效率，挑選轉染效率較高的慢病毒載體，建立了穩(wěn)定高表達ST8Sia1的WM451細胞株，并在mRNA和蛋白質水平檢測ST8Sia1的表達。結果顯示，ST8Sia1過表達慢病毒感染后，WM451細胞的ST8Sia1 mRNA表達水平明顯提高，約為對照組的500倍，而在蛋白水平僅為對照組的2倍。我們認為造成該現(xiàn)象的原因可能是因為基因轉錄和mRNA翻譯是兩個不同水平的過程。mRNA翻譯為蛋白質是一個更為復雜的過程，受到了多種因素影響，例如mRNA的選擇性剪接、翻譯后修飾和蛋白質降解等，所以導致與基因mRNA表達水平發(fā)生不一致。隨后，我們用獲得的穩(wěn)轉細胞株檢測了ST8Sia1過表達對黑色素瘤細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)ST8Sia1過表達可以促進WM451細胞增殖和克隆形成。本研究為課題組進一步開展ST8Sia1基因在黑色素瘤中的功能和作用機制的研究，以及動物水平研究奠定了重要基礎。