鐘 軼，鄭晴予，賈 寧，孫承艷，韓 錕

(錦州醫(yī)科大學 1. 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、2. 基礎醫(yī)學院解剖學教研室，遼寧 錦州 121001)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)為一種年齡相關的神經(jīng)退行性疾病，是最常見的癡呆類型。目前認為AD發(fā)病伴隨著嚴重自噬損害，主要表現(xiàn)為自噬底物降解受阻，自噬溶酶體堆積[1]，細胞中β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)、tau蛋白等自噬體內(nèi)待降解的物質(zhì)堆積，引起細胞毒性損害，導致AD的發(fā)生[2]。

葒草苷(orientin)是一種碳苷類黃酮化合物，為葒草、竹葉、金蓮花的主要活性成分。研究表明，葒草苷能夠改善Aβ以及噪音誘導的癡呆小鼠的認知功能[3-4]。但葒草苷改善癡呆鼠認知功能的機制尚不清楚。本研究擬初步探討葒草苷通過改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠自噬功能，從而改善認知功能，尋找潛在的AD防治藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 7月齡SPF級APPswe/PS1△E9雙轉(zhuǎn)基因♀小鼠16只，同月齡的♀C57BL/6J小鼠8只，購自中國醫(yī)科大學動物實驗中心，許可證號：SYXK(遼)2008-005。

1.1.2藥物與試劑 葒草苷(純度≥98%)，購自成都曼思特；Aβ抗體，購自CST；LC3、Beclin-1抗體，購自武漢三鷹； p62、組織蛋白酶D(Cathepsin D)抗體，購自沈陽萬類生物；DAB、通用SP試劑盒，購自北京中杉金橋。

1.1.3儀器 Morris水迷宮(安徽正華生物)；顯微鏡(日本Olympus)；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1動物分組與處理 將16只APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M(transgenic control group, Tg)和葒草苷處理組(Tg+Ori)，每組8只；8只同月齡C57BL/6J小鼠作為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M(non-transgenic control group, NT)。葒草苷組連續(xù)30 d每天腹腔注射生理鹽水稀釋的葒草苷(10 mg·kg-1)，Tg和NT組給予同劑量的生理鹽水。由于轉(zhuǎn)基因鼠不易獲得，因此本課題未設置葒草苷多個劑量組，僅初步探討葒草苷的藥理作用，未探索最佳給藥劑量。

1.2.2水迷宮行為學檢測 給藥結(jié)束24 h后，進行Morris水迷宮實驗，實驗分為定位航行和空間探索實驗兩部分，實驗過程參照Vorhees等[5]方法。

1.2.3取材 小鼠行為學檢測結(jié)束后，以水合氯醛麻醉，生理鹽水左心室灌注后斷頭取腦，一半置于多聚甲醛中行后固定，用于免疫組化染色；另一半取海馬，置于-80 ℃低溫冰箱儲存，用于免疫印跡檢測。

1.2.4免疫組化檢測Aβ的表達 小鼠腦經(jīng)石蠟包埋、切片后，脫蠟至水，抗原修復，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，Aβ抗體(1 ∶800)4 ℃孵育過夜，生物素化二抗、辣根酶標記卵白素孵育，DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明封片后，顯微鏡下觀察攝片。

1.2.5免疫印跡檢測海馬自噬相關蛋白表達 海馬組織剪碎后，以RIPA緩沖液和超聲裂解細胞，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h， p62、LC3、Cathepsin D、Beclin-1抗體(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，二抗孵育2 h，ECL發(fā)光。

1.2.6統(tǒng)計學分析 以軟件SPSS 16.0進行統(tǒng)計學分析，多組比較用F檢驗。方差齊，兩兩比較用q檢驗，方差不齊用Dunnett檢驗。

2 結(jié)果

2.1 葒草苷改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠空間學習和記憶功能如Fig 1A所示，各組小鼠逃避潛伏期隨訓練天數(shù)的增加，均有逐漸下降的趨勢。與NT組相比，Tg組小鼠逃避潛伏期延長(P<0.01)；與Tg相比，Tg+Ori組逃避潛伏期縮短(P<0.05)。各組小鼠的游泳速度無差異(Fig 1B)。表明轉(zhuǎn)基因小鼠空間學習能力受損，葒草苷能夠改善轉(zhuǎn)基因小鼠空間學習能力。

如Fig 1C、1D所示，與NT組相比，Tg組小鼠穿過平臺象限的次數(shù)和所處時間均減少(P<0.01)；與Tg組相比，Tg+Ori組小鼠穿過平臺象限的次數(shù)和所處時間均增加(P<0.05)。表明轉(zhuǎn)基因小鼠記憶能力降低，葒草苷能夠改善轉(zhuǎn)基因小鼠空間記憶能力。

Fig 1 Cognition of APP/PS1 mice improved by orientin treatment n=8)

A: Spatial learning and memory were assessed by the measurement of escape latency; B: Swimming speed was assessed; C, D: The number of times entered the target zone and the time spent in it during 120 s probe trail; E: Representative swimming paths on day 8 of training.#P<0.05,##P<0.01vsNT;*P<0.05,**P<0.01vsTg.

2.2 葒草苷改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ沉積Fig 2的Aβ免疫組化染色結(jié)果顯示，與NT組相比，Tg組小鼠海馬出現(xiàn)大量的Aβ陽性染色區(qū)域(P<0.01)；與Tg組相比，葒草苷組小鼠Aβ陽性染色所占面積百分比降低(P<0.01)。表明Tg小鼠表現(xiàn)為海馬Aβ沉積，葒草苷能夠減少轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ沉積。

Fig 2 Amyloid plaques of APP/PS1 mice reduced by orientin treatment n=4)

A:Brain sections were stained with an anti-Aβ antibody (×400); B: The relative area occupied by Aβ was measured##P<0.01vsNT;**P<0.01vsTg.

2.3 葒草苷對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬自噬相關蛋白表達的影響為了探究葒草苷對小鼠自噬的影響，檢測自噬典型標記物LC3、p62、Beclin-1和Cathepsin D的表達。如Fig 3所示，與NT組相比，Tg組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、p62、Cathepsin D表達升高(P<0.05，P<0.01)；與Tg組相比，葒草苷組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、p62、Cathepsin D表達降低(P<0.05)。組間Beclin-1表達無差異。提示轉(zhuǎn)基因小鼠自噬體堆積，葒草苷能夠調(diào)控轉(zhuǎn)基因小鼠自噬，促進自噬底物降解。

3 討論

目前AD確切的病因和致病機制仍不清楚，Aβ瀑布理論仍然是最廣為接受的發(fā)病機制假說[6]。

Fig 3 Effects of orientin on autophagy related proteins in hippocampus of APP/PS1 mice n=4)

#P<0.05,##P<0.01vsNT;*P<0.05vsTg

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠是把人源性的APPswe和PS1△E9基因敲入到小鼠基因組中，能夠較好地模擬AD患者的臨床表現(xiàn)和病理改變[7-8]，是研究AD的可靠模型。研究表明，葒草苷具有抗衰老、抗炎、抗抑郁、抗氧化應激、增強自噬[9]、抑制凋亡等作用[10]，這些均與AD的發(fā)病密切相關。因此，葒草苷可能是一個潛在的多靶點作用的AD防治藥物，但葒草苷治療AD的確切機制仍不是很清楚。認知功能障礙是AD最重要的臨床表現(xiàn)。本研究提示，葒草苷能夠減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦Aβ沉積，從而改善學習記憶功能。

自噬是存在于真核細胞生物中保守的細胞內(nèi)物質(zhì)降解方式，能夠選擇性吞噬降解細胞內(nèi)受損細胞器、易聚集蛋白、病原體等有害物質(zhì)，并釋放營養(yǎng)成分，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。近期研究表明，包括AD在內(nèi)的表現(xiàn)為蛋白異常聚集的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病往往伴隨著腦部自噬損害，主要表現(xiàn)為自噬內(nèi)容物降解受阻、自噬溶酶體堆積[1]。LC3是典型的自噬標志物之一，在自噬體形成和成熟中起著重要作用，自噬體形成過程中，胞質(zhì)型LC3酶解形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)榇嬖谟谧允审w的膜型LC3-Ⅱ， LC3-Ⅱ蛋白表達能夠反映細胞內(nèi)成熟自噬體的數(shù)量，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值反映自噬水平的變化[11]。對小鼠海馬LC3檢測結(jié)果提示，Tg組小鼠海馬LC3-Ⅱ表達(結(jié)果未列出)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值均升高，提示轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬自噬體數(shù)量增加，自噬處于高水平。p62能夠識別、連接待降解自噬內(nèi)容物，并通過與LC3-Ⅱ的連接，將自噬內(nèi)容物募集到自噬體內(nèi)[12]。p62檢測結(jié)果表明，組間p62變化趨勢和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的結(jié)果一致，表現(xiàn)為Tg組p62表達升高，葒草苷組p62表達下降。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62下降的原因可能是自噬誘導降低或(和)自噬溶酶體降解增加。為了明確自噬水平降低的原因，分別對自噬誘導及降解相關蛋白Beclin-1和Cathepsin D進行檢測。Beclin-1在調(diào)控自噬體生成中起著不可或缺的作用[13]，其蛋白表達能夠反映自噬誘導水平。本實驗結(jié)果表明，各組間Beclin-1蛋白表達無差異，提示各實驗組動物的自噬誘導無差異，即葒草苷組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62的下降可能并非自噬誘導水平下降所致。Cathepsin D是人體內(nèi)唯一天冬氨酸蛋白水解酶，通過降解自噬溶酶體和內(nèi)吞體中未折疊或氧化性聚集蛋白，在維持神經(jīng)元細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著不可替代的作用。Cathepsin D有3種構(gòu)型：存在于高爾基復合物的分子質(zhì)量為53 ku的無活性的前體蛋白，轉(zhuǎn)運至內(nèi)吞體后修飾成為分子質(zhì)量為48 ku的具有酶活性的單鏈蛋白中間體，以及進一步轉(zhuǎn)運至溶酶體并修飾成為分子質(zhì)量為31 ku的具有酶活性的成熟雙鏈結(jié)構(gòu)[14]。本實驗結(jié)果提示，Tg組成熟型Cathepsin D、LC3-Ⅱ和p62均升高，與Lee等[15]的研究結(jié)果一致，葒草苷組均表現(xiàn)為降低，提示APP/PS1小鼠海馬未降解的自噬溶酶體增多，葒草苷能夠促進自噬內(nèi)容物降解，改善轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦部自噬溶酶體底物堆積。

本實驗結(jié)果表明，葒草苷能促進APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦自噬底物降解、減少自噬體堆積，進而減少腦內(nèi)Aβ沉積，從而改善學習記憶障礙。因此，葒草苷可能是一個潛在的多靶點作用的AD防治藥物。

(致謝：本實驗在錦州醫(yī)科大學生命科學院公共實驗平臺完成，感謝王宇教授的指導和幫助)